四环素类(tetracyclines,tcs)是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，主要包括四环素(tetracycline,tc)、土霉素(oxytetracycline,otc)、金霉素(chlortetracyline,ctc)等，其结构均含并四苯基本骨架，已被广泛应用于可食性动物疾病的治疗和药物添加剂中，常用于预防和治疗动物疾病。四环素类抗生素在酸性和碱性条件下均不稳定，其含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物，与钙或镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐，与铁离子形成红色络合物，与铝离子形成黄色络合物。为了有效地预防四环素类药物的滥用，欧盟、日本和美国等都制定了动物组织及牛奶中的最大残留限量，其中规定在动物组织中的最大残留限量为0.1 mg/l。gb/t 21317-2007中规定最低检出限为50.0μg/kg。
(1) 样品提取
称取5.0g(精确到0.01g)均质好的试样，置于50ml离心管中，分别加入20ml、20ml、10ml 配置好的0.1mol/l的edta-mcllivaine缓冲溶液，1000rpm涡旋混合1min，再超声提取10min，于3000rpm离心5min，合并上清液(控制上清液体积不超过50ml)并定容至50ml，混匀，5000rpm离心10min，用快速滤纸过滤，待净化。
(2) 净化方法
先将cleanert pep-2小柱分别用5ml甲醇和5ml水活化，再准确吸取10ml提取液以1滴/s的速度过spe小柱，待样液完全流出后，依次用5ml水和5ml 5%甲醇水溶液淋洗，弃去全部流出液。减压抽干小柱5min，最后用10ml甲醇 乙酸乙酯(1:9，v/v)洗脱。将洗脱液低于40℃氮气吹干，用1ml甲醇水(3:7，v/v)溶液溶解残渣，过0.45μm滤膜，待测。
(3) 检测方法
3.1 色谱条件
色谱柱：durashell c18，2.1×50mm，3μm，100å；
流动相：a相-0.3%甲酸水溶液，b相-0.3%甲酸乙腈
柱 温：30℃；
进样量：5μl；
梯度洗脱：见下表
时间(min) | 流速 (ml/min) | a/% | b/% |
0 | 0.2 | 90 | 10 |
1 | 0.2 | 10 | 90 |
8 | 0.2 | 60 | 40 |
8.1 | 0.2 | 10 | 90 |
9 | 0.2 | 90 | 10 |
15 | 0.2 | 90 | 10 |
3.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子源 扫描方式：正离子扫描
电喷雾电压：5500 v 雾化气压力：70 psi
气帘气压力：15 psi 辅助气压力：65 psi
离子源温度：550℃ 采集方式：多反应监测(mrm)
q1、q3均为单位分辨率
定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞电压(见表2)
化合物 | q1 | q3 | ce/v |
盐酸四环素 | 445 | 410 | 37 |
(tetracycline hydrochloride) | 428 | 37 | |
盐酸土霉素 | 461 | 426 | 27 |
(oxytetracycline) | 443 | 27 | |
盐酸金霉素(chlorotetracycline hydrochloride | 479 | 444 | 29 |
462 | 29 |
(4) 实验结果
由表3可知，采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法检测三种四环素类药物，加标量为10.0μg/kg、50.0μg/kg、200μg/kg，回收率为90%~105%，能够满足检测要求。
由图1-3可看出经cleanert pep-2固相萃取柱净化，采用durashell c18色谱柱检测能够使三种四环素药物得到良好的分离，且各种物质峰形良好，保留时间稳定。
物质名称 | 加标量/(μg/kg) | 处理加标回收率/% | rsd/% | rt/min |
盐酸四环素 | 10 | 97.05 | 3.63 | 4.91 |
(tetracycline | 50 | 100.46 | 2.08 | |
hydrochloride) | 200 | 96.71 | 0.12 | |
盐酸土霉素 | 10 | 96.66 | 2.22 | 3.84 |
(oxytetracycline) | 50 | 99.82 | 0.87 | |
200 | 97.49 | 3.77 | ||
盐酸金霉素 | 10 | 91.87 | 7.62 | 7.06 |
(chlorotetracycline | 50 | 92.52 | 0.21 | |
hydrochloride) | 200 | 94.94 | 1.94 |
图1 四环素类样品加标10.0μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图：
图2 四环素类样品加标50μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图：
图3 四环素类样品加标200μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图：
结论：
本实验建立了三种四环素类药物的lc-ms/ms检测方法。实验对加标量为10μg/kg、50μg/kg、200μg/kg的样品进行了检测，结果表明前处理方法回收率在90%-105%之间，均在国标要求范围内，固相萃取方法稳定而且色谱柱重现性较好。说明本方法能够用于检测动物源性食品中的四环素类药物残留。
(5) 订货信息：
产品名称 | 规格包装 | 订货号 |
durashell c18 | 3μm,100å,2.1×50mm | dc930502-0 |
cleanert pep-2 | 60mg/3ml,50支/包 | pe0603-2 |
qdaura卓睿自动固相萃取仪 | 24通道 | spe-40 |
保护柱套 | 适用于4.6×10mm和2.1×10mm | sh-100 |
直联式保护柱芯 | 3μm,100å,2.1×10mm | dc930102-0s |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写32×11.6mm,100/pk | 1109-0519 |
1.5ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫,45．shore a 1.0mm,100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜(nylon) | 13mm,0.45μm,200/pk | as021345 |
一次性注射器 | 2ml两件式 无针头,100/pk | lzsq-2ml |
乙腈uv级 | 4l/瓶,色谱纯 | 015-4 |
甲醇 | 4l/瓶,色谱纯 | s230-4 |
应用编号：af10039
