(1) 样品：新西兰 婴儿配方奶粉(0~6个月)
(2) 样品提取及净化
称取1g试样于50ml具塞离心管中，加2ml水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2ml乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10ml的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入新一代cleanert mas-quchers管中(500mg/15ml)，将mas管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液(约10ml)于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈-水混合溶液(97：3)复溶，过0.22μm滤器，待测。
注：a. 做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；
b.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果；
c. 净化液氮气吹干后，如发现有少量油脂，可采用1ml乙腈：水(97：3)混合溶液复溶，之后加入1ml正己烷(色谱纯)液液萃取，取下层溶液过0.22μm针式过滤器，进样检测。
(3) 检测方法
3.1 高效液相色谱法
色谱柱：venusil hilic(5μm，100å，4.6×250mm)；
流动相： 10mmol/l乙酸铵(ph为4.0)：乙腈=3：97；
波长：220nm；进样量：10μl；柱温：30℃；
流速：0.8ml/min。
注：本实验选用的奶粉经过净化后，按10mmol/l乙酸铵(ph为4.0)：乙腈=15：85液相条件，有一个杂质与双氰胺完全重合，经实验
条件优化后，确定流动相条件为10mmol/l乙酸铵(ph为4.0)：乙腈=3：97，双氰胺保留时间为9.3min，可以和杂质完全分离。
3.2 液相色谱串联质谱法
色谱柱：venusil hilic(5μm，100å，2.1×150mm)；
流动相：a：0.5mmol/l乙酸铵(ph为4.0) b：乙腈；
进样量：10μl；柱温：30℃；流速：0.3 ml/min。
表2 流动相梯度程序：
时间(min) | a% | b% |
0 | 10 | 90 |
0.4 | 50 | 50 |
1.8 | 50 | 50 |
1.9 | 10 | 90 |
7 | 10 | 90 |
*备注：本文曾尝试过多种c18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于lc-ms/ms；也曾尝试过merck zic-hilic柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的venusil hilic柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。
质谱条件：
质谱仪：api 4000 ；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；cad：8.00；
cur：20.00；gs1：60.00；gs2：50.00；is：5500.00；
tem：600.00。
表3 双氰胺质谱信息：
药物名称 | 监测离子对 | dp | ep | ce | cxp |
双氰胺 | 85.1/68.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
85.1/43.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
4. 结果与讨论
4.1 高效液相色谱法
图3 双氰胺10μg/ml标准溶液的液相色谱图：
实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5μg/g，1μg/g，2μg/g，5.0μg/ml和10μg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：
表4 双氰胺线性方程和定量限(hplc法)：
名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | 最低定量限(s/n=10) |
双氰胺 | 5.57min | y=108.16x 27.827 | 0.9971 | 0.5μg/g |
准确度和精密度
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5
表5 0.5μg/g添加回收实验结果(hplc法)：
平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 | rsd |
82.30% | 85.50% | 89.10% | 85.63% | 3.97% |
图4 奶粉0.5μg/g添加谱图：
图5 奶粉空白谱图：
4.2 lc-ms/ms法：
图6 双氰胺10ng/ml标准溶液质谱图：
实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和200ng/ml的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：
表6 双氰胺线性方程和定量限(lc-ms/ms法)：
名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | 最低定量限(s/n=10) |
双氰胺 | 3.15min | y=3859.1x 23694 | 0.99 | 2ng/g |
准确度和精密度
选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。
表7 10ng/g添加回收实验结果：
平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 | rsd |
82.50% | 83.50% | 89.30% | 85.20% | 4.31% |
图 7 婴幼儿奶粉空白质谱图：
图 8 婴幼儿奶粉10ng/g 添加水平的质谱图：
(4) 订货信息
产品名称 | 规格包装 | 订货 |
新一代mas-quchers-双氰胺净化管(填料量加大，更适合婴幼儿奶粉等复杂样品) | 500mg/15ml,50支/包 | ms-sqa02 |
mas-quchers-双氰胺净化管 | 100mg/2ml,50支/包 | ms-sqa01 |
venusil®hilic | 4.6×250mm,5μm,100å | vh952505-0 |
液相色谱柱 | 2.1×150mm,5μm,100å | vh951502-0 |
针式过滤器(nylon) | 0.22μm,直径13mm, 200/pk | as021320 |
一次性注射器，无针头 | 5ml,100/pk | zsq-5ml |
双氰胺对照品 | 500mg /瓶,含量≥99.0% | dcd-0001 |
1g/瓶,含量≥99.0% | dcd-0002 | |
离心管 | 50ml,带螺纹盖,25个/包 | lxg0050 |
1.5ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写32×11.6mm, 100/pk | 1109-0519 |
1.5ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫,45．shore a 1.0mm,100/pk | 0915-1819 |
乙腈 | 4×4l/箱 | ah015-4 |
应用编号：af10045
