前言
维生素b1又称硫胺素或抗神经炎维生素或抗脚气病维生素，由嘧啶环和噻唑环通过亚甲基结合而成的一种b族维生素。维生素b1主要存在于种子的外皮和胚芽中，如米糠和麸皮中含量很丰富，在酵母菌中含量也极丰富。瘦肉、白菜和芹菜中含量也较丰富。所用的维生素b1都是化学合成的产品。在体内，维生素b1以辅酶形式参与糖的分解代谢，有保护神经系统的作用；还能促进肠胃蠕动，增加食欲。维生素b1缺乏时，可引起多种神经炎症，如脚气病。维生素b1缺乏所引起的多发性神经炎，患者的周围神经末梢有发炎和退化现象，并伴有四肢麻木、肌肉萎缩、心力衰竭、下肢水肿等症状。在现代医学上，维生素b1制剂治疗脚气病和多种神经炎症有显著疗效。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
高效液相色谱仪-荧光检测器
试剂材料
正丁醇、铁氰化钾、氢氧化钠、盐酸、乙酸钠、氯化钙均为分析纯；
冰乙酸、甲醇为色谱纯
维生素b1标准品（纯度99%）：盐酸硫胺素，cas 67-03-8；
木瓜蛋白酶：应不含维生素b1，酶活力≥800 u（活力单位）/mg；
淀粉酶：应不含维生素b1，酶活力≥3700 u/g；
20 g/l铁氰化钾溶液：称取2 g铁氰化钾，用水溶解并定容至100 ml，摇匀；
100 g/l氢氧化钠溶液：称取25 g氢氧化钠，用水溶解并定容至250 ml，摇匀；
碱性铁氰化钾溶液：将5 ml上述铁氰化钾溶液与200 ml上述氢氧化钠溶液混合，摇匀；
0.1 mol/l盐酸溶液：移取8.5 ml盐酸，加水稀释至1000 ml，摇匀；
0.01 mol/l盐酸溶液：量取0.1 mol/l盐酸溶液50 ml，用水稀释并定容至500 ml，摇匀；
0.05 mol/l乙酸钠溶液：称取6.08 g乙酸钠，加900 ml水溶解，用冰乙酸调节ph为4.0 ~ 5.0之间，加水定容至1000 ml，经0.45 µm微孔滤膜过滤后使用；
2.0 mol/l乙酸钠溶液：称取27.2 g乙酸钠，用水溶解并定容至100 ml，摇匀；
混合酶溶液：称取1.76 g木瓜蛋白酶、1.27 g淀粉酶，加水定容至50 ml，涡旋，使呈混悬状液体，冷藏保存。
样品制备
样品提取
称取3 g ~ 5 g固体试样或者10 g ~ 20 g液体试样于100 ml锥形瓶中（带有软质塞子），加60 ml 0.1 mol/l盐酸溶液，充分摇匀，塞上软质塞子，高压灭菌锅中121℃保持30 min。水解结束待冷却至40℃取出，轻摇数次，用2.0 mol/l乙酸钠溶液调节ph至4.0左右，加入2 ml（可根据酶活力不同适当调整用量）混合酶溶液，摇匀后，置于培养箱中37℃过夜（约16 h），将酶解液全部转移至100 ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，离心或者过滤，取上清液备用。
样品衍生化
准确移取上述上清液或者滤液2 ml于10 ml试管中，加入1 ml碱性铁氰化钾溶液，涡旋混匀后，准确加入2 ml正丁醇，再次涡旋混匀1.5 min后静置约10 min或者离心，待充分分层后，吸取正丁醇相（上层）经0.45 µm微孔滤膜过滤，取滤液于2 ml棕色进样瓶中，待检测。若样品中维生素b1浓度超出线性范围的最高浓度值，应取上清液稀释适宜倍数后，重新衍生后进样。
实验条件
液相条件
色谱柱：venusil® xbp c18(2) 5 µm， 4.6 × 250 mm，100 å
流动相：0.05 mol/l乙酸钠溶液︰甲醇 = 65︰35
荧光检测器检测波长：激发波长375 nm，发射波长435 nm
流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl
结果与讨论
实验结果
经图1、图2可知，采用venusil xbp c18(2)色谱柱检测婴幼儿配方奶粉中的维生素b1，峰形良好，保留时间稳定，能够满足实验要求。
图1 维生素b1标准溶液
图2 婴幼儿配方奶粉中的维生素b1
结论
本实验依据gb 5009.84-2016第一法，用venusil xbp c18(2)（5 µm，100 å，4.6 × 250 mm）检测婴幼儿配方奶粉中的维生素b1，并结合液相色谱-荧光检测器对样品进行了检测，结果维生素b1保留时间稳定，峰形良好，说明venusil xbp c18(2)（5 µm，100 å，4.6 × 250 mm）能够用于婴幼儿配方奶粉中维生素b1的检测。
注意事项
按照国标法进行样品前处理时回收率较低，可采用先热超声提取，再经过酸沉淀蛋白后直接衍生化的方法加以改善。热超声时要注意温度的控制，以防止维生素b1遭到破坏。
因维生素b1为强极性化合物实验中应注意流动相比例的确定，且流动相的ph对出峰时间影响较大，因此在每次开始实验前，要调节流动相ph 值到相同的值。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
venusil xbp c18（2） | 4.6 × 250 mm, 5µm, 100 å | 1支 | vx952505-2 |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a; 1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜 | 尼龙，50 mm，0.45 µm | 100片 | am025045 |
应用编号：af10010
