丙烯酰胺（acylamide；cas登记号79-06-1）是一种无色、无臭透明片状晶体；可溶于水、醇、丙酮、醚和三氯甲烷，微溶于甲苯，不溶于苯和庚烷。相对分子质量为71.08，结构式如图1所示。丙烯酰胺是一种公认的神经毒素和准致癌物，动物实验和体外细胞实验都证明丙烯酰胺还可导致遗传物质发生改变，早在2005年国际癌症研究机构就已将其列为2a级致癌物质。2002年4月，瑞典国家食品管理局发现许多含淀粉的食物经过煎、烤、炸等高温烹调后会产生高含量的丙烯酰胺。众多研究表明薯条、薯片等土豆制品中丙烯酰胺的含量最高，超过饮用水中允许最大限度的500多倍。
因此通过有效的实验技术手段，对食品中的丙烯酰胺进行监控，以确保消费者对食品消费的安全具有重要意义。本实验参照国标法一法，使用cleanert® aca固相萃取柱对样品净化，建立了快速、有效的食品中丙烯酰胺的lc-ms/ms检测方法。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
ab sciex api 4000 液相质谱联用仪；qdaura®卓睿全自动固相萃取仪；
试剂材料
某品牌原味薯片、油条；甲酸、甲醇、正己烷皆为色谱纯；屈臣氏水；丙烯酰胺标准品（纯度 > 99%），水溶解；d3-丙烯酰胺标准溶液（cd2=cdconh2）（浓度500 mg/l，溶剂乙腈）;
基质标准工作溶液：
0.1%甲酸溶液：移取100 μl甲酸并加入100 ml水，摇匀；一次性无菌注射器；尼龙针式过滤器(0.22 μm，直径13 mm)；cleanert® aca固相萃取柱：200 mg/6 ml。
样品制备
样品提取
准确称取粉碎后的1 g样品置于50 ml离心管中，加入200 μl d3-丙烯酰胺内标（1 mg/l），再加入10 ml水，超声振荡30 min后，于8000 r/min离心5 min，将上清液转移到15 ml离心管中，加入5 ml正己烷，漩涡萃取1 min，以6000 r/min的速度离心5 min，除去上层有机相，再用5 ml正己烷重复萃取一次，之后迅速取5 ml水相作为上样液。
样品净化
手动操作
cleanert® aca固相萃取柱（200 mg/6 ml）使用前依次用5 ml甲醇、5 ml水活化，将上样液上cleanert® aca固相萃取柱，并用5 ml水洗涤，真空抽干小柱，用5 ml甲醇洗脱，并收集全部洗脱液，于40℃下氮吹浓缩至近干，用水定容至1 ml，待lc-ms/ms检测。
qdaura®卓睿全自动固相萃取仪操作程序
先将cleanert® aca固相萃取柱安装在仪器上，并将样品注入到上样管里，按下图中程序自动操作：
色谱条件
液相条件
色谱柱：venusil® mp c18，5 μm，100 å，2.1 × 150 mm；
流动相：0.1%甲酸水溶液；
柱 温：26℃；
流 速：0.2 ml/min；
进样量：2 μl。
质谱条件
离子源：esi ；电喷雾电压：5500 v；雾化气压力：45 psi；气帘气压力：10 psi；辅助气压力：45 psi；离子源温度：330℃；采集方式：多反应监测(mrm)。
表1. 丙烯酰胺质谱参数
物质名称 | q1 | q3 | ce/v |
丙烯酰胺 | 72 | 55 | 15 |
44 | 15 | ||
d3-丙烯酰胺 | 75 | 58 | 16 |
44 | 25 |
结果与讨论
线性关系
分别配制浓度为0.01 mg/l、0.05 mg/ l、0.1 mg/l、0.5 mg/l、1 mg/l、3 mg/l的丙烯酰胺标准溶液（内标：0.1 mg/l），进行液相色谱-质谱/质谱检测，以各标准溶液的丙烯酰胺进样浓度（mg/l）为横坐标，以丙烯酰胺的峰面积与内标d3-丙烯酰胺的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示，拟合参数如表2。
表2. 丙烯酰胺标准曲线和检出限
化合物名称 | 标准曲线方程 | 相关系数 | 检出限(mg/l，s/n = 3) |
丙烯酰胺 | y = 9.41 x 0.0706 | 0.9999 | 0.005 |
实验结果
由表3可知，采用cleanert® aca固相萃取柱结合液相色谱-质谱/质谱法检测丙烯酰胺，当丙烯酰胺的加标量分别为0.1 mg/kg和2 mg/kg时，回收率均在100% ~ 110%之间，满足检测要求。
表3. 丙烯酰胺加标回收实验结果(n=3)
物质名称 | 操作方式 | 添加水平/(mg/kg) | 保留时间/min | 平均回收率/% | rsd/% | ||
薯片 | 油条 | 薯片 | 油条 | ||||
丙烯酰胺 | 自动 | 0.1 | 3.52 | 101.7 | 101.2 | 4.5 | 1.6 |
手动 | 2.0 | 100.4 | 102.7 | 1.4 | 2.0 | ||
结论
本实验参照《食品中丙烯酰胺的测定》gb 5009.204-2014中第一法——稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法，使用cleanert® aca固相萃取柱建立了食品中丙烯酰胺的检测方法，并用内标法结合lc-ms/ms对食品中丙烯酰胺含量进行了测定。当加标量为0.1 mg/kg和2 mg/kg时，回收率均在100% ~ 110%之间，符合要求。该方法的定量限为60 μg/kg。
讨论
与国标法相比，该方法具有诸多优点：
1、从操作过程上说，该方法操作简单，只需要使用一根固相萃取柱，而国标法需要使用两根固相萃取柱；该方法操作时间短，前处理整个过程只需要4 h，而国标法则需要12 h以上；
2、从净化效果上说，该方法除杂效果比国标法好，如下图所示为薯片基质用该方法和国标法处理的lc-ms/ms谱图，从图中可以看到国标法处理的杂质峰的峰高是该方法的10倍左右；
3、从实验结果上说，该方法和国标法都存在基质效应（me），且me < 100%，即皆为离子抑制效应。本实验方法对薯片和油条基质的me分别为90%和87%，而国标法对薯片和油条基质的me分别为23%和35%，本实验方法的me更接近100%，因此本实验的基质效应更小。从绝对回收率上看，本实验对薯片和油条的回收率分别为76.6%和63.4%，而国标法对薯片和油条的绝对回收率只有22.3%和32.7%。（注：me =（空白样品处理后加标响应峰面积-空白样品丙烯酰胺响应峰面积）/溶剂标响应峰面积。）
表4. 丙烯酰胺加标回收实验结果(n=3)
物质名称 | 前处理方法 | 添加水平/(mg/kg) | 保留时间/% | 平均回收率/% （绝对） | rsd/% | me/% | |||
薯片 | 油条 | 薯片 | 油条 | 薯片 | 油条 | ||||
丙烯酰胺 | aca | 2.0 | 3.52 | 76.6 | 63.4 | 4.0 | 0.2 | 90 | 87 |
国标 | 22.3 | 32.7 | 5.7 | 1.2 | 23 | 35 | |||
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
venusil® mp c18 | 5 μm,100 å, 2.1 × 150 mm | 1支 | va951502-0 |
cleanert® aca | 200 mg/6ml | 30支 | aca2006 |
qdaura®卓睿全自动固相萃取仪 | 24位，四通道 | 1台 | spe-40 |
氮吹仪 | 15位 | 1台 | nv15-m |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a; 1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
针式过滤器(nylon) | 单膜，13 mm，0.22 µm | 200个/包 | as021320 |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
甲醇 | 4 l/瓶，色谱纯 | 4 × 4 l/箱 | ah230-4 |
正己烷 | 4 l/瓶，hplc级 | 4 × 4 l/箱 | ah216-4 |
应用编号：af10095
