丙烯酰胺（acylamide；cas登记号79-06-1）是一种无色、无臭透明片状晶体；可溶于水、醇、丙酮、醚和三氯甲烷，微溶于甲苯，不溶于苯和庚烷。相对分子质量为71.08，结构式如图1所示。丙烯酰胺是一种公认的神经毒素和准致癌物，动物实验和体外细胞实验都证明丙烯酰胺还可导致遗传物质发生改变，早在2005年国际癌症研究机构就已将其列为2a级致癌物质。2002年4月，瑞典国家食品管理局发现许多含淀粉的食物经过煎、烤、炸等高温烹调后会产生高含量的丙烯酰胺。众多研究表明薯条、薯片等土豆制品中丙烯酰胺的含量最高，超过饮用水中允许最大限度的500多倍。
因此通过有效的实验技术手段，对食品中的丙烯酰胺进行监控，以确保消费者对食品消费的安全具有重要意义。
本实验通过优化前处理方法建立了丙烯酰胺在食品中的lc-ms/ms方法。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
ab sciex api 4000 液相质谱联用仪；
试剂材料
某品牌原味薯片、油条；甲酸、甲醇、正己烷皆为色谱纯；屈臣氏水；丙烯酰胺标准品（纯度 > 99%），用水溶；
d3-丙烯酰胺标准溶液（cd2=cdconh2）（浓度500 mg/l，溶剂乙腈）;80%甲醇水溶液：取20 ml水，加甲醇稀释定容至100 ml；
0.1%甲酸溶液：移取100 μl甲酸并加入100 ml水，摇匀；一次性无菌注射器；尼龙针式过滤器(0.22 μm，直径13 mm)；
cleanert® pep固相萃取柱：200 mg/6 ml；cleanert® sas固相萃取柱：200 mg/3 ml。
样品制备
样品提取
准确称取粉碎后的1 g样品置于50 ml离心管中，加入200 μl d3-丙烯酰胺内标（1 mg/l），再加入10 ml水，超声振荡30 min后，于8000 r/min离心5 min，将上清液转移到15 ml离心管中，加入5 ml正己烷，漩涡萃取1 min，以6000 r/min的速度离心5 min，除去上层有机相，再用5 ml正己烷重复萃取一次，之后迅速取5 ml水相作为上样液。
样品净化
cleanert® pep固相萃取柱（200 mg/6 ml）使用前依次用3 ml甲醇、3 ml水活化，将上述上样液上cleanert® pep固相萃取柱，收集上样液，并用4 ml 80%的甲醇水溶液洗脱，合并收集全部洗脱液，该洗脱液待用cleanert®sas固相萃取柱净化；cleanert®sas固相萃取柱（200 mg/3 ml）依次用3 ml甲醇、3 ml水活化，将上述洗脱液全部上样，在重力作用下流出，收集全部流出液，并用2 ml甲醇洗脱，合并收集全部洗脱液。于40℃下氮吹浓缩至近干，用水定容至1 ml，待lc-ms/ms检测。
注：上述操作步骤可在qdaura®卓睿全自动固相萃取仪上完成。
色谱条件
液相条件
色谱柱：venusil® mp c18，5 μm，100 å，2.1 × 150 mm；
流动相： 0.1%甲酸水溶液；
柱 温：26℃；
流 速：0.2 ml/min；
进样量：2 μl。
质谱条件
离子源：esi ；电喷雾电压：5500 v；雾化气压力：45 psi；气帘气压力：10 psi；辅助气压力：45 psi；离子源温度：330℃；采集方式：多反应监测(mrm)。
表1. 丙烯酰胺质谱参数
物质名称 | q1 | q3 | ce/v |
丙烯酰胺 | 72 | 55 | 15 |
44 | 15 | ||
d3-丙烯酰胺 | 75 | 58 | 16 |
44 | 25 |
结果与讨论
线性关系
分别配制浓度为0.01 mg/l、0.05 mg/ l、0.1 mg/l、0.5 mg/l、1 mg/l、3 mg/l的丙烯酰胺标准溶液（内标：0.1 mg/l），进行液相色谱-质谱/质谱检测，以各标准溶液的丙烯酰胺进样浓度（mg/l）为横坐标，以丙烯酰胺的峰面积与内标d3-丙烯酰胺的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示，拟合参数如表2。
表2. 丙烯酰胺标准曲线和检出限
化合物名称 | 标准曲线方程 | 相关系数 | 检出限(mg/l，s/n = 3) |
丙烯酰胺 | y = 9.41 x 0.0706 | 0.9999 | 0.005 |
实验结果
由表3可知，采用固相萃取结合液相色谱-质谱/质谱法检测丙烯酰胺，内标法定量，丙烯酰胺的加标回收率在100% ~ 115%之间，满足检测要求。
表3.丙烯酰胺加标回收实验结果(n=3)
物质名称 | 添加水平（mg/kg） | 出峰时间 | 平均回收率（%） | rsd（%） | ||
薯片 | 油条 | 薯片 | 油条 | |||
丙烯酰胺 | 2.0 | 3.56 | 108.6 | 113.6 | 3.33 | 2.77 |
结论
本实验依据《食品中丙烯酰胺的测定》gb 5009.204-2014中第一法——稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法建立了食品中丙烯酰胺的检测方法，并用内标法结合lc-ms/ms对食品中丙烯酰胺含量进行了测定。当加标量为2.0 mg/kg时，回收率在100% ~ 115%之间，符合要求。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
venusil® mp c18 | 5 μm,100 å, 2.1 × 150 mm | 1支 | va951502-0 |
cleanert® pep | 200 mg/6ml | 30支 | pe2006 |
cleanert®sas | 200 mg/3ml | 50支 | ss2003 |
qdaura®卓睿全自动固相萃取仪 | 24位，四通道 | 1台 | spe-40 |
氮吹仪 | 15位 | 1台 | nv15-m |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a; 1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
针式过滤器(nylon) | 单膜，13 mm，0.22 µm | 200个/包 | as021320 |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
甲醇 | 4 l/瓶，色谱纯 | 4 × 4 l/箱 | ah230-4 |
正己烷 | 4 l/瓶，hplc级 | 4 × 4 l/箱 | ah216-4 |
应用编号：af10096
