皮革奶，是用皮革水解蛋白生产出来的乳制品，加入到乳制品中的目的是提高产品蛋白含量。皮革水解蛋白本身对人体无害，但由于皮革水解蛋白中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，长期服用会导致重金属中毒。l-羟脯氨酸是胶原蛋白(皮革水解蛋白)特征性成份之一，而乳制品中的乳蛋白中不存在，故将l-羟脯氨酸的检测作为判定乳及乳制品中是否含有水解蛋白的依据。
本实验采用异硫氰酸苯酯(pitc)作为衍生剂，使用venusil® aa氨基酸分析专用柱对5种市售乳制品中l-羟脯氨酸进行测试。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
agilent 1100高效液相色谱仪、agela technology 15位干式电模块氮吹仪；
试剂材料
色谱柱：venusil®aa；5 μm；4.6 × 250 mm；
l-羟脯氨酸标准品：白色晶体，纯度≥98%；异硫氰酸苯酯：纯度≥99.0%；屈臣氏蒸馏水；乙腈为色谱纯；无水醋酸钠、苯酚、浓盐酸、冰醋酸均为分析纯；
水解液：6.0 mol/l盐酸溶液(含1%苯酚)；
稀盐酸：0.1 mol/l盐酸；
三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4 ml，加乙腈8.6 ml，混匀；
异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯25 μl，加乙腈2 ml，混匀；
0.1mol/l醋酸钠缓冲液（ph=6.5）：称取8.23g无水醋酸钠，加1000ml水溶解，冰醋酸调节ph至6.5；
标准储备液1000 μg/ml：准确称取10 mg标准品于10 ml容量瓶中，用0.1 mol/l盐酸溶解并定容至刻度，即得；
标准工作液100 μg/ml：用0.1mol/l盐酸稀释标准储备液至100 μg/ml。
样品水解
准确称取样品1 g(奶粉样品称取0.2 g)，置于12 ml水解管中，加入8 ml水解液，振摇使样品均匀分散于溶液中，然后将水解管置110℃烘箱中水解24小时，取出冷却，打开水解管，将水解液全部转移至20 ml玻璃试管中,用0.1mol/l盐酸定容到刻度，混匀，过滤，取滤液，作为衍生用样品溶液。
样品衍生
准确量取衍生用样品溶液1.0 ml，置一玻璃管中，用氮吹仪于50℃下氮吹至干，残渣加1.0 ml 稀盐酸复溶，混匀，量取200 μl水解后样品溶液于5 ml玻璃试管中，依次加入100 μl三乙胺乙腈溶液，100 μl异硫氰酸苯酯乙腈溶液，摇匀，于室温下放置1 h，然后加入正己烷800 μl，振摇后放置10分钟，取下层溶液，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液200 μl，加水800 μl稀释后上机测试。
l-羟脯氨酸标准曲线的绘制用l-羟脯氨酸标准工作液分别配成0.125、0.25、1.25、2.5、6.25 μg/ml的标准系列溶液，采用上述衍生方法，使用外标法定量，绘制标准曲线。
色谱条件
色谱柱：venusil®aa；5 μm；4.6 × 250 mm；
流 速：1.0 ml/min；
柱 温：40 ℃；
波长：254 nm；
进样量：20 μl；
流动相a：0.1 mol/l醋酸钠缓冲液(冰醋酸调节ph=6.5) ︰乙腈=1000︰75；
流动相b：乙腈︰水=80︰20；
梯 度：
表1.梯度洗脱程序
时间/min | a/% | b/% |
0 | 100 | 0 |
2 | 100 | 0 |
10 | 88 | 12 |
19 | 70 | 30 |
21 | 50 | 50 |
22 | 0 | 100 |
26 | 0 | 100 |
26.1 | 100 | 0 |
30 | 100 | 0 |
结果与讨论
方法学考察
标准曲线及检出限
按照上述色谱条件，分别对l-羟脯氨酸系列标准溶液进样测试，l-羟脯氨酸在浓度0.125-6.25mg/l范围内有线性关系良好，回归方程为y = 12.607x 0.5205，相关系数为0.9999，检出限（s/n=3）为1.5 mg/kg。
方法的精密度与回收率
精密度实验
在上述色谱条件下，使用1.25 μg/ml标准溶液连续进样6次对仪器精密度进行测试，表明方法重现性好，结果见下表2。
表2. 重复性实验数据
保留时间/min | 峰面积 | |
平均值 | 7.818 | 17.2 |
rsd/% | 0.30 | 0.90 |
市售乳制品检测及加标回收实验按上述的处理方法，对5种市售乳制品(牛奶、乳品饮料、奶粉、原味酸奶及大果粒酸奶) 分别进行加标实验，并计算回收率，加标浓度及回收率结果见表3，l-羟脯氨酸的加标平均回收率在90-110%之间，相对标准偏差小于5%，该方法的回收率好。
表3. 市售乳制品中l-羟脯氨酸的相关回收率
市售乳制品 | 加标浓度(mg/kg) | 平均回收率/% | rsd/% |
奶粉 | 50 | 106.6 | 3.12 |
125 | 103.1 | 1.79 | |
625 | 89.3 | 2.00 | |
牛奶 | 10 | 91.8 | 3.27 |
25 | 100.6 | 2.34 | |
125 | 96.7 | 0.86 | |
乳品饮料 | 10 | 108.2 | 3.06 |
25 | 101.9 | 1.08 | |
125 | 99.9 | 0.87 | |
酸奶 | 10 | 109.8 | 3.34 |
25 | 102.5 | 4.56 | |
125 | 99.8 | 1.23 | |
大果粒 | 10 | 109.8 | 3.22 |
25 | 100.6 | 1.72 | |
125 | 103.3 | 1.16 |
结论
根据实验结果，采用venusil®aa氨基酸分析专用柱，以异硫氰酸苯酯（pitc）为衍生试剂测试乳制品中的l-羟脯氨酸，方法灵敏度高、重现性好，可用于判定乳制品中是否添加皮革水解蛋白。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
venusil®aa氨基酸分析专用柱 | 4.6 × 250 mm，5 μm | 1 | aa952505-0 |
12 ml螺纹棕色样品瓶 | 66*18.5mm | 100/pk | 1509-1800 |
1.5ml棕色样品瓶 | 短螺纹棕色；带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | av1011-0 |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a；1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜 | 单膜，13 mm，0.45 μm | 100个/包 | as021345-t |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
乙腈 | 4 l/瓶，色谱纯 | 4×4 l/箱 | ah015-4 |
应用编号：af10092
