碘醚柳胺（rafoxanide，cas号：22662-39-1）又名重碘柳胺，为灰白色至棕色粉末。在丙酮中溶解，在氯仿或乙酸乙酯中略溶，在甲醇中微溶，在水中不溶。相对分子质量为626.01，结构式如图1所示。碘醚柳胺属卤化水杨酰苯胺类吸虫药，它主要是通过阻断肝片吸虫的氧化磷酸化过程，而使虫体麻痹、死亡，达到杀虫的目的，在世界范围内被广泛用于牛羊的肝片吸虫病的治疗，疗效显著。有研究表明该物质可致小鼠畸变，欧盟也对动物源性食品中碘醚柳胺的临时性最大残留量做了规定。因此通过有效的实验技术手段，对动物源性食品中碘醚柳胺进行监控，具有重要意义。本实验采用固相萃取结合高效液相色谱法建立了一种快速、有效的牛、羊组织中碘醚柳胺的检测方法。
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
agilent 1260高效液相色谱仪；
博纳艾杰尔12位负压spe装置。
试剂材料
碘醚柳胺标准品（纯度99%），乙腈溶解；
乙腈、甲酸为色谱纯；实验用水为超纯水；
1%甲酸酸化乙腈：量取甲酸1 ml，加乙腈溶解并稀释至100 ml，摇匀；
一次性无菌注射器；nylon针式过滤器(0.45 μm，直径13 mm)；
cleanert® pax固相萃取柱：150 mg/6 ml。
样品制备
样品提取
准确称取绞碎的样品10 g于50 ml离心管中，加乙腈20 ml，10000 r/min涡旋均质1 min，4000 r/min离心5 min，移取上清液。残渣再用10 ml乙腈重复提取一次，合并上清液。
样品净化
cleanert® pax固相萃取小柱先用5 ml乙腈活化，之后将上述提取液以1 ml/min的流速全部上样过柱。用5 ml乙腈淋洗小柱，真空抽干，用10 ml 1%甲酸酸化乙腈洗脱并收集。洗脱液于40℃下氮气吹干，残留物用乙腈溶解并定容至0.5 ml，过0.45 μm滤膜，待测。
注：上述操作步骤可在qdaura®卓睿全自动固相萃取仪上完成。
色谱条件
色谱柱：durashell c18，5 μm，100 å，4.6 × 150 mm；
流动相：磷酸水溶液（ph 2.5）︰乙腈 = 15︰85；
柱 温：30℃；
波 长：282 nm；
进样量：20 μl；
结果与讨论
线性关系
分别配制浓度为0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、10 μg/ml的碘醚柳胺标准工作液，按上述液相色谱条件检测，测定结果经线性回归，线性范围是0.05 - 10 μg/ml，回归方程、相关系数详见表1。
表1. 碘醚柳胺标准溶液回归方程及相关系数
检测方法稳定性
使用15 μg/ml的标准溶液，连续进样6针，记录每针碘醚柳胺的保留时间和峰面积，计算其相对标准偏差，结果见表2。
表2. 碘醚柳胺保留时间和峰面积rsd值
实验结果
从表3可知，采用cleanert® pax固相萃取小柱结合高效液相色谱法检测牛肉、牛肾、羊肉、羊肾和羊油基质中的碘醚柳胺，当牛肉基质中加标浓度在15 μg/kg ~ 60 μg/kg时，回收率在91% ~ 101%之间；牛肾基质中加标浓度在20 μg/kg ~ 80 μg/kg时，回收率在76% ~ 81%之间；羊肉基质中加标浓度在100 μg/kg ~ 400 μg/kg时，回收率在74% ~ 95%之间；羊肾基质中加标浓度在75 μg/kg ~ 300 μg/kg时，回收率在78% ~ 92%之间；羊油基质中加标浓度在100 μg/kg ~ 500 μg/kg时，回收率在64% ~ 77%之间；且各基质的最低定量限均小于欧盟规定的最大残留限量（mrl），满足检测要求。
表3. 碘醚柳胺加标实验结果
结论
本实验采用 cleanert® pax固相萃取小柱结合高效液相色谱建立了动物源性食品中碘醚柳胺的检测方法，并采用外标法定量，当碘醚柳胺的加标量在15 μg/kg ~ 500 μg/kg时，回收率在64% ~ 101%之间，且该方法对样品基质中的碘醚柳胺的定量限小于欧盟的mrl要求，满足检测要求。
应用编号：af10102
