叶酸是20 世纪40 年代中后期被发现分离出来的水溶性b 族维生素，是具有喋酰古氨酸分子结构的一类化合物的总称。自然界存在100多种叶酸衍生物，在人血浆中主要以5-甲基四氢叶酸形式存在。研究表明，叶酸除了与巨幼红细胞性贫血有关以外，还与神经管畸形、某些癌症( 如结肠癌)、心脑血管疾病以及儿童智力低下有关。因此，快速、准确地测定人组织中的叶酸，对于预防、诊断和治疗由叶酸引起的疾病都有十分重要的意义。由于叶酸的稳定性差且组成复杂，因此对叶酸的分析具有很大挑战。本应用案例采用cleanert pax 96孔板进行血清中叶酸及5-甲基四氢叶酸含量检测样品预处理，并使用lc-ms/ms进行样品测试，实验方法具有良好的稳定性及可靠性。
目标物信息
图1 叶酸结构图
图2 5-甲基四氢叶酸结构图
材料及仪器
cleanert pax 96孔板（30 mg/well）， 96位氮吹仪，96位正压装置，96孔接收板，venusil mp c18(2)（3.0*100mm, 3μm, 110å），以上产品均为天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；lc/ms/ms型号为api 4000 （sciex）。
样品处理方法
样品预处理
由于叶酸稳定性差，为防止叶酸分解，在实验中需要加入抗氧化剂，所用抗氧化剂为维生素c、2-巯基乙醇。取400 μl样品至2 ml离心管中，加入400 μl水溶液，振荡混匀2 min，待净化。
spe过程
活化：依次加入1 ml甲醇，500μl水，500μl含抗氧化剂的水溶液，使用正压装置将溶液压下；
上样：将混合好的800 μl溶液上样，自然流下；
淋洗：依次加入含抗氧化剂的500μl 0.1%甲酸水溶液，250 μl含抗氧化剂的甲醇溶液，使用正压装置，吹干；
洗脱：500ul 2% 甲酸甲醇洗脱，自然流下；将洗脱液在37℃下温和氮吹干，使用100μl水复溶，进样检测。
仪器检测条件
hplc条件
色谱柱：venusil mp c18(2)（3.00*100mm，3μm，110å）
流速：500μl/min
柱温：30℃
进样量：10μl
流动相：a-0.1%甲酸水溶液b-0.1%甲酸甲醇
表1 梯度条件
t | a% | b% |
0 | 95 | 5 |
1 | 95 | 5 |
1.01 | 20 | 80 |
5 | 20 | 80 |
5.01 | 95 | 5 |
10 | 95 | 5 |
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（mrm）
表2 参数信息
化合物 | 保留时间/min | q1 | q3 | ce |
叶酸 | 3.73 | 442.4 | 295.1 | 26 |
442.4 | 175.9 | 56 | ||
5-甲基四氢叶酸 | 3.54 | 460.3 | 313.2 | 23 |
460.3 | 193.6 | 43 |
结果
图3 标准溶液色谱图（20ng/ml）
图4 血清样品色谱图
图5 血清加标样色谱图（加标浓度20ng/ml）
图6 后加标样色谱图（浓度20ng/ml）
血清中叶酸临床指标为6–20.1 ng/ml（正常）、3.0—6.0 ng/ml（不确定）、≤3.0 ng/ml（临床表现缺乏），为考察方法精密度与准确度，取加标浓度分别为1ng/ml、5ng/ml、20ng/ml的血清样作为方法学考察样品，结果见表3，为考察基质效应，本实验进行后加标操作，结果表明基质效应因子＜9%。
根据目标物响应，将样品进行稀释并进行重复测定，标示浓度与计算值偏差在±20%之内，获得叶酸、5-甲基四氢叶酸的最低定量浓度分别为0.05ng/ml、0.08ng/ml.
表3 血清加标回收率
目标物 | 加标浓度1ng/ml | 加标浓度5ng/ml | 加标浓度20ng/ml | |||
平均回收率（n=5） | rsd （n=5） | 平均回收率 （n=5） | rsd （n=5） | 平均回收率（n=5） | rsd（n=5） | |
5-甲基四氢叶酸 | 89.6% | 8.9% | 105.8% | 5.4% | 101.2% | 3.3% |
叶酸 | 91.5% | 10.2% | 99.4% | 3.7% | 95.8% | 2.3% |
结论
本实验使用cleanert® pax提取血清中的叶酸和5-甲基四氢叶酸，在1ng/ml-20ng/ml回收率均大于89%，rsd低浓度时不高于11%，高浓度时小于5%，叶酸、5-甲基四氢叶酸的最低定量浓度分别为0.05ng/ml、0.08ng/ml。同时使用96孔正压和氮吹装置大大提高了样品的处理速度，能充分满足实验室的检测需求。
订货信息表
产品名称 | 规格/包装 | 订货号 |
cleanert pax 96孔板 | 96孔板，30mg/well | ax0302-w |
cleanert m96 生物样品前处理仪 | 与96孔板匹配 | spe-m96 |
cleanert v96 氮吹浓缩仪 | 与96孔板匹配 | nv-96g |
venusil mp c18(2) | 3.0*100mm,3μm,110 å | va931003-2 |
96位接收板 | 1ml/well，与96孔板匹配 | 96sp1036 |
甲醇 | lc-ms级, 4*2.5l | lc230 |
水 | lc-ms级，4*2.5l/箱 | lc365 |
应用编号：yb10003
