25-羟基维生素d，简称25-oh vd，包括25-羟基维生素d2（25-oh vd2）和25-羟基维生素d3（25-oh vd3）作为维生素d在体内的主要代谢形式之一，由于其半衰期长、存在形式稳定而被认为是维生素d营养水平的标志物。如何快速准确检测人体内维生素d的水平越来越受到广大学者和医患人员的重视。液相色谱-串联质谱法（lc-ms/ms）具有特异性强、准确性高的特点，被认为是评价维生素d营养状况的“黄金标准”测定法。本应用案例采用cleanert sle 96孔板进行血清样品前处理，并使用lc-ms/ms进行样品测试，结果表明该实验方法具有良好的稳定性及可靠性，可为临床研究提供一种米乐网页的解决方案。
目标物信息
材料及仪器
cleanert sle 96孔板（300mg/well）、cleanert m96 生物样品前处理仪、cleanert v96 样品氮吹浓缩仪、96孔接收板及durashell c18-l（3.0*50 mm, 5 μm, 150 å）均来自天津博纳艾杰尔科技有限公司；lc-ms/ms, qtrap 5500（sciex）；25-oh vd2，25-oh vd3，d3-25-oh vd2以上三种标准品由合作单位提供赞助；d6-25-oh vd3（购自altascientific）；甲醇；甲酸；水；氢氧化钠；异辛烷。
样品处理方法
样品预处理
取100 μl血清至洁净样品瓶中，加入内标溶液，再加入100 μl 50 mm氢氧化钠水溶液混匀后待净化。
sle过程
上样：把预处理的样品全部上样，待全部浸润后静置5 min。
洗脱：用2 ml的异辛烷进行洗脱，每次洗脱加入500 μl，最后一步洗脱结束，将cleanert sle与收集板整体放到cleanert m96 生物样品前处理仪上，开启压力至0.02 mpa，约30 s，完全收集洗脱液。
将洗脱液室温下用cleanert v96 样品氮吹浓缩仪进行温和氮吹干，使用200 μl 0.1% fa 甲醇/水（8/2）复溶，进样检测。
仪器检测条件
hplc条件
色谱柱：durashell c18-l（3.0*50 mm, 5 μm, 150 å）
流速：500 μl/min
柱温：30 ℃
进样量：5 μl
表1 液相条件
step | total time(min) | flow rate(µl/min) | 0.1%甲酸 水 (%) | 0.1%甲酸甲醇 (%) |
0 | 0 | 500 | 10 | 90 |
1 | 3.5 | 500 | 10 | 90 |
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（mrm）
表2 参数信息
化合物 | 保留时间/min | q1 | q3 | ce |
25-oh vd2 | 1.81 | 413.3 | 395.3 | 13.5 |
413.3 | 355.4 | 14.1 | ||
d3-25-oh vd2 | 1.79 | 416.5 | 398.4 | 12.3 |
416.5 | 358.5 | 15 | ||
25-oh vd3 | 1.71 | 401.5 | 383.5 | 13.8 |
401.5 | 365.5 | 15.1 | ||
d6-25-oh vd3 | 1.69 | 407.5 | 389.5 | 13.8 |
407.5 | 371.5 | 15.1 |
结果
线性范围与灵敏度
使用不含目标物的血清样品配制10个不同浓度的校准曲线点，25-oh vd2的浓度分别为：2、4、10、30、60、120、200、400、800、1000 ng/ml；25-oh vd3的浓度分别为：1、2、5、15、30、60、100、200、400、500 ng/ml；所得样品采用上述样品前处理方法净化样品并进行检测，获得结果见表3。
表3 线性范围及灵敏度
化合物 | 回归方程 | 相关系数（r2） | 方法定量限loq(ng/ml) |
25-oh vd2 | y=0.00691x 0.043 | 0.9998 | 1.1 |
25-oh vd3 | y=0.0203x 0.398 | 0.9995 | 0.16 |
方法精密度与准确度
为考察方法精密度与准确度，取低、中、高三个浓度的样本，每个浓度平行处理5个样，获得数据见表4.
表4 精密度与准确度
化合物 | 加标浓度 | 平均回收率 | rsd |
25-oh vd2 | 4 | 101.8% | 8.3% |
30 | 95.6% | 7.2% | |
200 | 96.8% | 4.0% | |
25-oh vd3 | 2 | 100.4% | 12.9% |
15 | 95.0% | 6.1% | |
100 | 93.5% | 4.3% |
色谱图
将经cleanert sle净化的样品按上述lc-ms/ms测试条件进行测试，获得谱图见图3-4.
血样中大量存在的磷脂是造成液质联用基质效应的主要原因，为考察ppt、lle与cleanert sle技术去除磷脂的能力，特取磷脂两对特征离子对进行考察：496/184, 524/184，获得对比图见图5-6.
图3 25-oh vd3血清加标色谱图（浓度为15 ng/ml）
图4 25-oh vd2血清加标色谱图（浓度为30 ng/ml）
图5 ppt-lle-sle样品磷脂对比谱图（离子对496/184）
图6 ppt-lle-sle样品磷脂对比谱图（离子对524/184）
结论
本应用呈现了一种简单、高效的样品前处理方法，通过cleanert sle 96孔板可高通量净化血样并萃取富集脂溶性维生素d代谢物25-oh vd2与25-oh vd3，本实验方法易操作且稳定，可在临床研究及药物代谢领域替代耗时、低效的液液萃取技术。
订货信息表
产品名称 | 规格/包装 | 订货号 |
cleanert sle 96孔板 | 96孔板 | hc2002sq-9w |
与96孔板匹配 | spe-m96 | |
与96孔板匹配 | nv-96g | |
96孔收集板 | 2 ml/well，与96孔板匹配 | 96sp2036-2 |
durashell c18-l | 3.0*50mm，5μm，150 å | dc950503-l |
甲醇 | lc-ms级, 4*2.5l | lc230 |
水 | lc-ms级，4*2.5l/箱 | lc365 |
应用编号：yb10011
