维生素a对人体多种器官的发育以及人体正常生理机能的维护有不可或缺的作用，然而过量摄入维生素a会引发毒副作用；维生素e作为一种抗氧化剂在体内的主要功能是保护细胞的生物膜结构，最近发现维生素e也能调控基因表达，维生素e缺乏症虽少见，却与新生儿发育不良和遗传代谢病相关。因此，准确测定人体内维生素a与维生素e具有重要意义。维生素a与维生素e由于化学性质活泼，易被氧化，对这类物质的准确定量具有很大的挑战。
本应用案例介绍一种液相色谱-串联质谱的方法，采用cleanert sle 96孔板净化血浆样品，从血浆样品中萃取富集维生素a（视黄醇，va）、α-生育酚（α-ve）和γ-生育酚（γ-ve），实验方法具有良好的稳定性及可靠性，可为va、ve临床研究提供一种米乐网页的解决方案。
目标物信息
材料及仪器
cleanert sle 96孔板（200μl/well），cleanert m96 生物样品前处理仪，cleanert v96 样品氮吹浓缩仪，96孔收集板，bonshell c18（2.1*100 mm, 2.7 μm），以上产品均为天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；lc-ms/ms, api 4000 （sciex）；va、α-ve、γ-ve、d6-α-ve、d4-γ-ve（以上5种标准品购自altascientific）；d6-va（购自buchem bv）；甲醇；甲酸；水；异辛烷；异丙醇；2, 6-二叔丁基对甲酚。
样品处理方法
样品预处理
由于va与ve稳定性差，为防止被氧化，在实验中需要加入抗氧化剂，所用抗氧化剂为2,6-二叔丁基对甲酚（bht）。
取100 μl血浆至洁净样品瓶中，加入内标溶液，再加入50 μl异丙醇和50 μl水溶液，涡旋振荡混匀。
sle过程
上样：将预混合好的溶液全部上样，静置5 min；
洗脱：2 ml 异辛烷/异丙醇 (9/1，含1 g/l bht)洗脱，每次加入500 μl，分四次洗脱，合并洗脱液；最后一步洗脱结束，将cleanert sle与收集板整体放到cleanert m96 生物样品前处理仪上，开启压力至0.005 mpa，约30 s，完全收集洗脱液。
将洗脱液在室温下用cleanert v96 样品氮吹浓缩仪进行温和氮吹干，再使用500μl 0.1%甲酸甲醇（含1 g/l bht）复溶，进样检测。
仪器检测条件
hplc条件
色谱柱：bonshell c18（2.1*100 mm, 2.7 μm）
流速：200 μl/min
柱温：30 ℃
进样量：5 μl
流动相条件：100%有机相（0.1%甲酸甲醇）等度分离6min
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（mrm）
表1 参数信息
化合物 | 保留时间/min | q1 | q3 | ce |
va | 1.87 | 269.3 | 93.1 | 31 |
269.3 | 81.2 | 23 | ||
d6-va | 1.85 | 274.3 | 88 | 33 |
274.3 | 212.3 | 27 | ||
α-ve | 4.3 | 431.5 | 165.1 | 25 |
431.5 | 137 | 57 | ||
d6-α-ve | 4.25 | 437.4 | 171.1 | 26 |
437.4 | 110.9 | 26 | ||
γ-ve | 3.79 | 417.5 | 151.2 | 25 |
417.5 | 304.3 | 14 | ||
d4-γ-ve | 3.76 | 421.6 | 155.1 | 26 |
421.6 | 111.1 | 22 |
结果
线性范围与灵敏度
根据目标物在人体内的含量范围确定标准曲线浓度范围，试验中使用不含目标物的血浆样品配制7个不同浓度的校准曲线点，va的浓度分别为：0.05、0.15、0.3、0.5、0.8、1、5 μg/ml；α-ve的浓度分别为：1、2、4、8、10、20、25 μg/ml；γ-ve的浓度分别为：0.2、0.5、1、1.5、3、4.5、8 μg/ml；所得样品采用上述样品前处理方法净化样品并进行检测，获得结果见表2。
表2 线性范围及灵敏度
化合物 | 回归方程 | 相关系数（r2） | 方法定量限loq(μg/ml) |
va | y = 1.3073x 0.5242 | 0.9963 | 0.012 |
α-ve | y = 1.5237x 0.1241 | 0.9914 | 0.022 |
γ-ve | y = 2.744x 0.0425 | 0.9979 | 0.034 |
方法精密度与准确度
为考察方法精密度与准确度，取低、中、高三个浓度的样本，每个浓度平行处理6个样，获得数据见表3.
表3 精密度与准确度
| 化合物 | 加标浓度μg/ml | 平均回收率（n=6） | rsd（n=6） |
va | 0.15 | 99.6% | 6.9% |
0.5 | 94.7% | 7.4% | |
1 | 95.4% | 1.7% | |
α-ve | 2 | 92.1% | 9.6% |
8 | 107.1% | 6.6% | |
20 | 93.0% | 4.9% | |
γ-ve | 0.5 | 101.3% | 3.5% |
1.5 | 112.2% | 6.8% | |
4.5 | 104.5% | 3.7% |
色谱图
将经cleanert sle净化的样品按上述lc-ms/ms测试条件进行测试，获得谱图见图4-6.
血样中大量存在的磷脂是造成液质联用基质效应的主要原因，为考察cleanert sle技术去除磷脂的能力，特取磷脂两对特征离子对同时进行考察：496/184，524/184，获得谱图见图7.
图4 va血浆加标色谱图（浓度为0.15μg/ml）
图5 α-ve血浆加标色谱图（浓度为2μg/ml）
图6 γ-ve血浆加标色谱图（浓度为0.5μg/ml）
图7 血浆加标样磷脂色谱图
结论
本应用介绍了一种简单、高效的样品前处理方法，通过cleanert sle 96孔板可高通量净化血样并萃取富集脂溶性维生素a与维生素e，本实验方法易操作且稳定，可在临床研究及药物代谢领域替代耗时、低效的液液萃取技术。
订货信息表
产品名称 | 规格/包装 | 订货号 |
cleanert sle 96孔板 | 96孔板，200μl/well | hc2002-9w |
cleanert m96 生物样品前处理仪 | 与96孔板匹配 | spe-m96 |
cleanert v96 样品氮吹浓缩仪 | 与96孔板匹配 | nv96-g-s |
96孔收集板 | 2ml/well，与96孔板匹配 | 96sp2036-y |
bonshell c18 | 2.1*100mm，2.7μm | sc921002-0 |
甲醇 | lc-ms级, 4*2.5l | lc230 |
水 | lc-ms级，4*2.5l/箱 | lc365 |
应用编号：yb10016
