类固醇激素又称为甾体激素，是内分泌细胞分泌的高效能生物化学物质。它们在维持生命、调节机体物质代谢、促进性器官发育和维持生育等方面起着重要作用。
类固醇激素在体内的含量较低，对其准确定量具有重要意义。本实验采用cleanert® pep 96微孔板对血清样品进行净化，建立了血清中类固醇激素的检测方法，该方法适合高通量样品前处理。
目标物信息
表1 化合物结构
化合物 | 英文名 | cas | 分子量 | 结构 |
氢化可的松 | hydrocortisone | 50-23-7 | 362.46 |
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睾酮 | testosterone | 58-22-0 | 288.42 |
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黄体酮 | progesterone | 57-83-0 | 386.5244 |
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醛固酮 | aldosterone | 52-39-1 | 360.44 |
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脱氢表雄酮 | dehydroepiandrosterone | 53-43-0 | 288.4 |
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材料及仪器
cleanert pep 96微孔板(5mg/1ml)；96孔板正压装置；96位接收板；venusil asb c18（2.1*50mm，3μm，150 å）；api 4000 。
样品处理方法
样品预处理
100μl血清样品与100μl 含有1%甲酸的甲醇/水溶液混合（50/50，v/v）
spe过程
活化：依次用200μl甲醇、200μl水活化；
上样：将预处理过的血清样品上样至96孔板中；
淋洗：加入400μl甲醇/水(35/65, v/v)用于淋洗样品中的干扰物；
洗脱：加入200μl 1%甲酸甲醇，用96位收集板收集洗脱液用于lc-ms/ms检测。（将洗脱液氮吹浓缩可获得更低的检测限）
仪器检测条件
hplc条件
色谱柱：venusil asb c18（2.1*50mm，3μm，150å）
流速：200μl/min
柱温：30℃
进样量：3μl
流动相：0.1%甲酸水/0.1%甲酸乙腈（ 40/ 60，v/v）
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（mrm）
表2 参数信息
id | tr/min | q1 | q3 | dp | ce |
氢化可的松 | 0.98 | 363.2 | 120.9 | 74 | 40 |
363.2 | 327.2 | 70 | 23 | ||
睾酮 | 1.66 | 289.4 | 97.1 | 100 | 31 |
289.4 | 109.1 | 90 | 40 | ||
醛固酮 | 0.98 | 361.3 | 325.3 | 84 | 30 |
361.3 | 315.4 | 77 | 29 | ||
脱氢表雄酮 | 1.66 | 289.4 | 253.4 | 70 | 24 |
289.4 | 213.1 | 71 | 23 | ||
黄体酮 | 3.15 | 315.4 | 97.1 | 95 | 35 |
315.4 | 109.1 | 95 | 39 |
结果
图1 30ppb类固醇激素标准溶液色谱图
图2 血清样品色谱图
图3 血清加标样色谱图（浓度为30ppb）
表3 加标回收率数据
加标浓度 | 醛固酮 | 氢化可的松 | 睾酮 | 脱氢表雄酮 | 黄体酮 |
30ppb | 85.9% | 87.0% | 105.5% | 110.6% | 97.7% |
结论
在临床检验中类固醇激素是一个难点。本实验使用cleanert® pep 96孔板提取血清中的类固醇，加快了检测速度，相较免疫法提高了最低检测浓度，回收率高于85%，可满足实验室检测相关物质的需要。
订货信息表
产品名称 | 规格/包装 | 订货号 |
cleanert pep | 96微孔板，5mg/1ml | pe00501-mw |
cleanert m96 生物样品前处理仪 | 与96孔板匹配 | spe-m96 |
cleanert v96 氮吹浓缩仪 | 与96孔板匹配 | nv-96g |
96位接收板 | 1ml，与96孔板匹配 | 96sp1036-y |
venusil asb c18 | 2.1*50mm，3μm,150 å | vs930502-0 |
甲醇 | hplc，4*4l | ah230-4 |
乙腈 | hplc，4*4l | ah015-4 |
水 | lc-ms级，4*2.5l/箱 | lc365 |
应用编号：yb10007
