背景
溶血磷脂酰胆碱（lyso-phosphatidylcholines,lpcs）是磷脂的一种，具有多种生理功能，与糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常等代谢性疾病和心血管疾病密切相关。lpcs主要在肝脏代谢，在肝脏疾病和肝毒性中可发生明显变化；近年来，学者们对多种肝脏疾病和化学性肝毒性模型的大量研究均涉及了lpcs。
本应用案例介绍一种液相色谱-串联质谱的方法，采用cleanert ppt 96孔板净化人血清样品，从血清样品中富集lpc 14:0、lpc 15:0、lpc 16:0、lpc 17:0、lpc 18:0五种溶血磷脂酰胆碱，该方法具有良好的稳定性及可靠性，可为溶血磷脂酰胆碱临床研究提供一种米乐网页的解决方案。
材料及仪器
cleanert ppt 蛋白沉淀板，cleanert m96 生物样品前处理仪，cleanert v96 样品氮吹浓缩仪，96孔收集板，durashell c18(l)（3.0*50 mm, 5 μm,150å），以上产品均为天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；lc-ms/ms, api 4000 （sciex）；lpc 14:0、lpc 15:0、lpc 16:0、lpc 17:0、lpc 18:0（以上5种标准品购自avanti）；利血平(内标)；甲醇；甲酸；水；生理盐水（0.9%）；甲酸铵。
样品处理方法
样品混合
由于难以获得不含目标物的基质，本实验使用生理盐水代替人血清进行方法学验证试验。为保护人血中溶血磷脂酰胆碱，试验中使用的甲醇均含有0.1% 2,6-二叔丁基对甲酚（bht）。
标准曲线及重现性试验中，基质为生理盐水，试验中取20μl生理盐水，加入5μl 标准工作液，涡旋混合均匀，待下一步净化。
人血清加标试验中，取20μl血清，加入5μl 标准工作液，涡旋混合均匀，待下一步净化。
蛋白沉淀过程
先向cleanert ppt每孔中加入150μl甲醇（含100ppb利血平），再加入预混合的样品，涡旋混合均匀，静置10min，使用cleanert m96将溶液收集至洁净收集板内。
cleanert v96温度设定为30℃，将收集板里的溶液氮吹干，使用1ml 80%甲醇水复溶，涡旋混合均匀，进样测试。
仪器检测条件
hplc条件
色谱柱：durashell c18(l) （3.0*50mm 5um 150å）
流速：800ul/min
柱温：30℃
进样量：5 μl
流动相条件
total time(min) | 0.1%甲酸25mm甲酸铵-水 (%) | 0.1%甲酸-甲醇(%) |
0 | 70 | 30 |
0.5 | 50 | 50 |
1 | 0 | 100 |
4 | 0 | 100 |
4.1 | 70 | 30 |
5 | stop | |
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（mrm）
表2 参数信息
目标物 | tr/min | q1 | q3 | dp | ce |
利血平 | 2 | 609.3 | 448.2 | 140 | 40 |
609.3 | 195* | 120 | 45 | ||
c14:0 | 2.46 | 468.4 | 285.3 | 110 | 40 |
468.4 | 450.4* | 120 | 27 | ||
c15:0 | 2.54 | 482.3 | 299.5 | 120 | 36 |
482.3 | 464.2* | 120 | 28 | ||
c16:0 | 2.63 | 496.4 | 478.2* | 124 | 16 |
c17:0 | 2.72 | 510.4 | 327.2 | 120 | 30 |
510.4 | 492.4* | 120 | 20 | ||
c18:0 | 2.83 | 524.5 | 341.5 | 115 | 28 |
524.5 | 506.2* | 127 | 18 |
注：*为定量离子对
结果
线性范围与灵敏度为考察方法线性范围，配置系列标准工作液，取5μl标准工作液至20μl生理盐水中进行前处理操作，获得的样品浓度参见 3中s1~s7，曲线方程等信息参见表3.
表3 标准曲线浓度及线性关系
项目 | c14:0 | c15:0 | c16:0 | c17:0 | c18:0 |
s1/ppm | 0.125 | 0.25 | 3.75 | 0.375 | 2.5 |
s2/ppm | 0.25 | 0.5 | 7.5 | 0.75 | 5 |
s3/ppm | 0.5 | 1 | 15 | 1.5 | 10 |
s4/ppm | 1.25 | 2.5 | 37.5 | 3.75 | 25 |
s5/ppm | 2.5 | 5 | 75 | 7.5 | 50 |
s6/ppm | 3.75 | 7.5 | 112.5 | 11.25 | 75 |
s7/ppm | 7.5 | 15 | 225 | 22.5 | 150 |
曲线方程 | y=0.725x 0.00264 | y=0.212x-0.0256 | y=0.212x 0.268 | y=0.366x 0.00653 | y=0.31x 0.287 |
相关系数 | 0.9965 | 0.9913 | 0.9956 | 0.9938 | 0.9961 |
loq/ppm | 0.027 | 0.12 | 0.32 | 0.059 | 0.072 |
方法精密度与准确度
实验中取生理盐水为基质，进行两个浓度（s3，s5）的加标回收率实验，分别进行两个平行样，结果见表4.
为考察方法精密度与准确度，取浓度水平为s3与s5分别进行8个样品的平行试验，s3对应lqc，s5对应hqc，基质为生理盐水，实验获得的数据见表5。
表4 生理盐水基质加标回收率数据
项目 | c14:0 | c15:0 | c16:0 | c17:0 | c18:0 |
低加标浓度/ppm | 1.25 | 2.5 | 37.5 | 3.75 | 25 |
高加标浓度/ppm | 3.75 | 7.5 | 113 | 11.3 | 75 |
低-实测浓度-1/ppm | 1.29 | 2.28 | 38.1 | 3.31 | 24.3 |
低-实测浓度-2/ppm | 1.44 | 2.85 | 43 | 4.09 | 28.1 |
低-回收率-1 | 103.2% | 91.2% | 101.6% | 88.3% | 97.2% |
低-回收率-2 | 114.4% | 114.0% | 114.7% | 109.1% | 112.4% |
高-实测浓度-1/ppm | 3.44 | 6.77 | 102 | 9.83 | 69.9 |
高-实测浓度-2/ppm | 3.35 | 6.53 | 103 | 9.94 | 69 |
高-回收率-1 | 91.7% | 90.3% | 90.3% | 87.0% | 93.2% |
高-回收率-2 | 89.3% | 87.1% | 91.2% | 88.0% | 92.0% |
表5 生理盐水基质精密度与准确度数据
项目 | c14:0 | c15:0 | c16:0 | c17:0 | c18:0 |
lqc平均回收率(n=8) | 96.3% | 99.9% | 103.6% | 96.6% | 100.0% |
cv(n=8) | 6.3% | 6.4% | 8.5% | 7.1% | 7.0% |
hqc平均回收率(n=8) | 96.8% | 99.1% | 97.5% | 93.8% | 97.7% |
cv(n=8) | 11.3% | 12.1% | 12.3% | 12.0% | 11.3% |
由表4及表5可见，此方法可用于处理及检测生理盐水基质中的溶血磷脂酰胆碱，为进一步考察方法对于血清样本的适应性，特取人血清进行加标回收率考察，获得数据见表6.由于人血清中含有浓度可观的溶血磷脂酰胆碱，实验检测两份人血清样品用于扣除内源性溶血磷脂酰胆碱，加标回收率计算公式为：
ca—加标样实测浓度
cm—人血清样品平均浓度
cs—加标浓度
表6 人血清基质实验数据
项目 | c14:0 | c15:0 | c16:0 | c17:0 | c18:0 |
低加标浓度/ppm | 1.25 | 2.5 | 37.5 | 3.75 | 25 |
高加标浓度/ppm | 3.75 | 7.5 | 113 | 11.3 | 75 |
人血清样品-1/ppm | 0.827 | 2.46 | 107 | 2.92 | 47.3 |
人血清样品-2/ppm | 0.678 | 2.21 | 92 | 2.45 | 39.4 |
低-实测浓度-1/ppm | 1.97 | 4.5 | 140 | 6.24 | 72 |
低-实测浓度-2/ppm | 2.17 | 4.99 | 136 | 6.67 | 70 |
低-回收率-1 | 97.4% | 86.6% | 108.0% | 94.8% | 114.6% |
低-回收率-2 | 113.4% | 106.2% | 97.3% | 106.3% | 106.6% |
高-实测浓度-1/ppm | 4.8 | 9.46 | 196 | 13.8 | 113 |
高-实测浓度-2/ppm | 4.72 | 9.69 | 216 | 14.8 | 122 |
高-回收率-1 | 107.9% | 95.0% | 85.4% | 98.4% | 92.9% |
高-回收率-2 | 105.3% | 98.1% | 103.1% | 107.2% | 104.9% |
图1 标准曲线s2点色谱图
图2 人血样品色谱图
实验结论
本应用使用蛋白沉淀的方式对生理盐水及人血清进行前处理，并使用lc-ms/ms检测溶血磷脂酰胆碱，结果表明本方法简单、稳定、易操作，可快速处理检测人血清中溶血磷脂酰胆碱含量，用于临床研究。
实验所用产品列表
产品名称 | 规格/包装 | 订货号 |
cleanert ppt | 96孔板，1ml/well | 96cd1025-m |
cleanert m96 生物样品前处理仪 | 与96孔板匹配 | spe-m96 |
cleanert v96 样品氮吹浓缩仪 | 与96孔板匹配 | nv-96g |
96孔收集板 | 2ml/well，与96孔板匹配 | 96sp2036-y |
durashell c18(l) | 3.0*50mm，5μm，150å | dc950503-l |
甲醇 | lc-ms级, 4*2.5l | lc230 |
水 | lc-ms级，4*2.5l/箱 | lc365 |
