前言
硝基咪唑类(nitroimidazoles)药物具有抗原虫和抗厌氧菌活性，临床上主要用于治疗畜禽的厌氧菌感染和防治各种原虫病。体内外毒理试验证实，硝基咪唑类药物具有致畸、致突变和致癌作用。因此我国农业部规定禁止甲硝唑、地美硝唑作为饲料添加剂用于食品动物，禁止洛硝达唑用于所有食品动物的任何用途。
本文通过对前处理方法的优化，建立了鱼肉中5种硝基咪唑类药物同时测定的分析方法。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
ab sceix api 4000 液相色谱串联质谱仪。
试剂材料
甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、乙酸铵均为色谱纯；氯化钠为分析纯；实验用水为超纯水；
5种硝基咪唑类药物混合标准工作溶液：羟甲基咪唑、2-甲硝咪唑、甲硝唑、洛硝达唑、羟基二甲硝咪唑：甲醇溶解；
cleanert® c18固相萃取小柱：1000 mg/6 ml。
样品制备
样品提取
称取均质好的鱼肉样品20 g置于250 ml具塞锥形瓶中，加入10 g硅藻土与样品充分混匀，再依次加入5 ml饱和氯化钠溶液水溶液和70 ml甲醇︰丙酮=3︰1（v/v），高速均质3 min。将提取液转移至离心管中，于10000 r/min条件下离心5 min，将上清液转移至250 ml浓缩瓶中，剩余残渣用甲醇︰丙酮=3︰1（v/v）重复提取两次，合并提取液。将提取液用40℃旋蒸至只剩余水相，转移至分液漏斗中，加入50 ml饱和氯化钠和25 ml乙酸乙酯，振摇3 min，静置分层，收集乙酸乙酯相，水相再用20 ml乙酸乙酯重复提取2次，合并乙酸乙酯相。再经约3 g的无水硫酸钠脱水，收集于浓缩瓶中，40℃旋蒸至近干，加入5 ml甲醇溶解残渣，并用0.45 µm nylon针式过滤器过滤，待净化。
样品净化
将cleanert® c18小柱用5 ml甲醇活化平衡，将上述待净化液全部上样于小柱上，收集流出液，再用10 ml甲醇洗脱小柱，收集流出液，合并两次流出液，于45℃下旋转蒸发至干，用流动相定容至1 ml，待检测。
基质混合标准工作溶液
取高浓度硝基咪唑混合标准溶液，用空白样品基质溶液稀释成0.02 µg/ml的基质混合标准工作溶液。
实验条件
色谱条件
色谱柱：venusil mp c18，3 µm，100 å，3.0 × 50 mm
流动相：a相-5 mmol乙酸铵溶液，b相-甲醇
柱 温：30℃
进样量：5 µl
梯度洗脱条件(见表1)
表1. 液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) | 流速(ml/min) | a% | b% |
0.0 | 0.3 | 95 | 5 |
1.0 | 0.3 | 95 | 5 |
3.5 | 0.3 | 10 | 90 |
6.0 | 0.3 | 10 | 90 |
6.1 | 0.3 | 95 | 5 |
10.0 | 0.3 | 95 | 5 |
质谱条件
离子源：esi ；电喷雾电压：5500 v；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：25 psi；辅助气压力：50 psi；离子源温度：500℃；采集方式：多反应监测(mrm)。
表2. 5种硝基咪唑类药物质谱参数
物质名称 | q1 | q3 | dp/v | ce/v |
羟甲基咪唑 | 187.7 | 126.2 | 64.0 | 25.0 |
123.3 | 64.0 | 18.0 | ||
2-甲硝咪唑 | 128.2 | 82.2 | 88.8 | 24.7 |
111.2 | 88.8 | 23.6 | ||
甲硝唑 | 172.0 | 128.2 | 63.0 | 21.2 |
82.2 | 63.0 | 36.7 | ||
洛硝达唑 | 201.4 | 140.2 | 80.0 | 17.0 |
145.0 | 80.0 | 35.0 | ||
羟基二甲硝咪唑 | 157.8 | 140.2 | 50.0 | 17.0 |
55.1 | 50.0 | 27.0 |
注：“下划线”为定量离子。
结果与讨论
由表3可知，采用spe结合lc-ms/ms的方法检测鱼肉中5种硝基咪唑类药物，加标回收率在90% ~ 110%之间，且变异系数小于10%，能够满足检测要求。从图1来看，用venusil mp c18色谱柱分离5种硝基咪唑类药物，分离效果良好。
表4. 鱼肉中5种硝基咪唑类药物加标回收实验结果(添加水平1.0 µg/kg)
物质名称 | 保留时间/min | 平均回收率/% | rsd/% |
羟甲基咪唑 | 3.19 | 108.0 | 4.0 |
2-甲硝咪唑 | 5.14 | 102.3 | 6.6 |
甲硝唑 | 5.14 | 104.4 | 5.0 |
洛硝达唑 | 4.99 | 100.3 | 5.5 |
羟基二甲硝咪唑 | 4.48 | 92.0 | 2.7 |
图1. 0.1 µg/ml 5种硝基咪唑类药物混合标准溶液色谱图
结论
本实验建立了鱼肉中5种硝基咪唑类药物的前处理方法，并结合lc-ms/ms对样品进行了检测。结果表明，对于加标量为1.0 µg/kg的鱼肉样品，加标回收率在90% ~ 110%之间，满足检测要求，且变异系数小于10%，稳定性良好。说明该方法适用于鱼肉中5种硝基咪唑类药物的同时检测。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
cleanert® s c18 | 1000 mg/6 ml | 30支/包 | s180006 |
卓睿全自动固相萃取仪 | 4通道，24位 | 1台 | spe-40 |
venusil mp c18 | 3 µm，100 å，3.0 × 50 mm | 1支 | va930503-0 |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
氮吹仪 | 15位 | 1台 | nv15-g |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a; 1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
尼龙针式过滤器 | 单膜，13 mm，0.22 µm | 200个/包 | as021320 |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
应用编号：af10147
