前言
孔雀石绿是人工合成的有机化合物。其生产是由1摩尔分子的苯甲醛（benzaldehyde）和2摩尔分子的二甲苯胺在浓盐酸混合下，加热缩合成隐色素碱（leuco base），在酸性条件下加过氧化铅使其氧化，并在碱性液中沉淀出色素碱。它属于三苯甲烷型的绿色染料。孔雀石绿是有毒的三苯甲烷类化学物，既是染料，也是杀真菌、杀细菌、杀寄生虫的药物，长期超量使用可致癌，无公害水产养殖领域国家明令禁止添加。
本文通过对国标方法的重现，建立了鱼肉中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫同时测定的分析方法。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
ab sceix api 4000 液相色谱串联质谱仪。
试剂材料
乙腈为色谱纯；实验用水为超纯水；乙酸铵为分析纯；
孔雀石绿、结晶紫混合标准工作溶液：孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，乙腈溶解；
内标标准溶液：氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿，2 ng/ml，乙腈︰5 mmol/l乙酸铵溶液=1︰1（v/v）溶解；
cleanert® alumina n固相萃取小柱：1000 mg/3 ml。
样品制备
样品提取
称取均质好的鱼肉样品5 g置于50 ml离心管中，加入200 µl 2 ng/ml的内标标准溶液，再加入11 ml乙腈，超声提取2 min，8000 r/min匀浆30 s，4000 r/min离心5 min，取全部上清液置于25 ml比色管中，取另一离心管加入11 ml乙腈洗涤匀浆刀头10 s，合并于装有样品残渣的离心管中，残渣用玻璃棒捣碎，涡旋30 s，超声振荡5 min，4000 r/min离心5 min，合并两次上清液，用乙腈定容至25 ml，摇匀，待净化。
样品净化
将cleanert® alumina-n小柱用5 ml乙腈活化，从上述待净化液中取出5 ml上样于小柱上，收集流出液于kd浓缩瓶中，再用4 ml乙腈洗涤小柱，收集流出液于同一kd浓缩瓶中，将流出液于45℃旋蒸至小于1 ml，用乙腈定容至1 ml，超声振荡5 min，加入1 ml 5 mmol/l乙酸铵溶液，超声振荡1 min，经0.22 µm尼龙针式过滤器过滤，待检测。
以上操作可用卓睿全自动固相萃取仪完成。
实验条件
色谱条件
色谱柱：venusil mp c18，3 µm，100 å，3.0 × 50 mm
流动相：a相-0.1%甲酸水溶液（v/v），b相-乙腈
柱 温：30℃
进样量：5 µl
梯度洗脱条件(见表1)
表1. 液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) | 流速(ml/min) | a% | b% |
0.0 | 0.3 | 60 | 40 |
1.0 | 0.3 | 60 | 40 |
2.0 | 0.3 | 10 | 90 |
6.0 | 0.3 | 10 | 90 |
6.1 | 0.3 | 60 | 40 |
10.0 | 0.3 | 60 | 40 |
质谱条件
离子源：esi ；电喷雾电压：5500 v；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：25 psi；辅助气压力：50 psi；离子源温度：500℃；采集方式：多反应监测(mrm)。
表2. 孔雀石绿质谱参数
物质名称 | q1 | q3 | dp/v | ce/v |
孔雀石绿 | 329.1 | 313.2 | 95.1 | 49.7 |
208.2 | 95.1 | 46.9 | ||
隐色孔雀石绿 | 331.1 | 239.3 | 105.1 | 42.0 |
316.3 | 105.1 | 30.5 | ||
结晶紫 | 372.4 | 251.4 | 112.1 | 53.4 |
358.4 | 112.1 | 47.3 | ||
隐色结晶紫 | 374.2 | 239.2 | 114.8 | 40.2 |
318.2 | 114.8 | 49.1 | ||
d5-孔雀石绿 | 334.0 | 318.2 | 97.0 | 53.1 |
213.3 | 97.0 | 48.9 | ||
d6-隐色孔雀石绿 | 337.4 | 240.2 | 107.4 | 40.8 |
322.4 | 107.4 | 31.5 |
注：“下划线”为定量离子。
结果与讨论
由表3可知，使用cleanert® alumina-n固相萃取小柱处理鱼肉基质，并结合lc-ms/ms检测鱼肉中的孔雀石绿与结晶紫，加标回收率在90% ~ 115%之间，且变异系数小于10%，能够满足检测要求。由图1可知，用venusil mp c18色谱柱分离孔雀石绿与结晶紫，分离效果良好。
表3. 鱼肉中孔雀石绿与结晶紫加标回收实验结果(添加水平2.5 µg/kg)
物质名称 | 保留时间/min | 平均回收率/% | cv/% |
孔雀石绿 | 1.65 | 90.3 | 4.4 |
隐色孔雀石绿 | 4.17 | 98.1 | 1.8 |
结晶紫 | 3.87 | 113.7 | 2.7 |
隐色结晶紫 | 1.46 | 97.0 | 1.5 |
图1. 0.01 µg/ml 孔雀石绿结晶紫混合标准溶液色谱图
结论
本实验建立了鱼肉中孔雀石绿与结晶紫的前处理方法，并结合lc-ms/ms对样品进行了检测。结果表明，对于加标量为2.5 µg/kg的鱼肉样品，加标回收率在90% ~ 115%之间，且变异系数小于10%，满足检测要求。说明该方法适用于鱼肉中孔雀石绿与结晶紫的检测。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
cleanert® alumina-n | 1000 mg/3 ml | 30支/包 | al0003-n |
卓睿全自动固相萃取仪 | 4通道，24位 | 1台 | spe-40 |
venusil mp c18 | 3 µm，100 å，3.0 × 50 mm | 1支 | va930503-0 |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
氮吹仪 | 15位 | 1台 | nv15-g |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a; 1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
尼龙针式过滤器 | 单膜，13 mm，0.22 µm | 200个/包 | as021320 |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
应用编号：af10146
