前言
氯霉素类属酰胺醇类广谱抗生素。包括氯霉素及其衍生物，主要有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。氯霉素有很强的毒副作用，能够导致再生障碍性贫血症，不可逆，且与使用剂量和频率无关，美国、欧盟、日本等很多国家都禁止在动物源性食品中检出。中国在2002年也把它列为违禁药物，禁止在动物食品中检出。甲砜霉素对血液系统的毒性比氯霉素小，但可以抑制人体免疫系统、红细胞和血小板的生成，除中国和日本外，欧共体和美国均禁用于食品动物。氟苯尼考虽不会引起再生障碍性贫血症，但对动物胚胎有影响。
本文通过对国标的重现，建立了鱼肉中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素同时测定的分析方法。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
ab sceix api 4000 液相色谱串联质谱仪。
试剂材料
乙腈、正己烷、丙酮为色谱纯；实验用水为超纯水；正丙醇为分析纯；
混合标准工作溶液：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考，甲醇溶解；
cleanert® silica固相萃取小柱：200 mg/3 ml。
样品制备
样品提取
称取均质好的鱼肉样品5 g置于50 ml离心管中，加入30 ml 乙腈，涡旋1 min，超声提取5 min，8000 r/min离心5 min，取全部上清液置于分液漏斗中，并向分液漏斗中加入15 ml乙腈饱和的正己烷溶液，震荡5 min，静置分层，转移乙腈层至鸡心瓶中，残渣再加入30 ml乙腈按照上述步骤液液萃取一次，合并两次提取液，向鸡心瓶中加入5 ml正丙醇，摇匀，40℃旋蒸至近干，再用氮气吹干，加入5 ml丙酮-正己烷（1 9）溶解，摇匀，待净化。
样品净化
将cleanert® silica小柱用5 ml丙酮/正己烷（v/v，1 9）活化平衡，将上述待净化液全部上样于小柱上，弃去流出液，再用5 ml丙酮-正己烷（v/v，6 4）洗脱小柱，收集流出液，于40℃下旋蒸至近干，用水定容至1 ml，待检测。
以上净化步骤可用卓睿全自动固相萃取仪完成。
实验条件
色谱条件
色谱柱：venusil mp c18， 3 µm，100 å，3.0 × 50 mm
流动相：a相-0.1%甲酸水溶液，b相-0.1%甲酸乙腈
柱 温：30℃
进样量：5 µl
梯度洗脱条件(见表1)
表1. 液相色谱梯度洗脱条件
时间/min | 流速/ml/min | a% | b% |
0.0 | 0.4 | 95 | 5 |
1.0 | 0.4 | 95 | 5 |
1.1 | 0.4 | 85 | 15 |
9.5 | 0.4 | 25 | 75 |
9.6 | 0.4 | 5 | 95 |
11.5 | 0.4 | 5 | 95 |
11.6 | 0.4 | 95 | 5 |
16.0 | 0.4 | 95 | 5 |
质谱条件
离子源：esi-；电喷雾电压：-4500 v；雾化气压力： 50 psi；气帘气压力：10 psi；辅助气压力：60 psi；离子源温度：550℃；采集方式：多反应监测(mrm)。
表2. 3种氯霉素类药物质谱参数
物质名称 | q1 | q3 | dp/v | ce/v |
氯霉素 | 321.0 | 152.1 | -75 | -24 |
256.9 | -75 | -17 | ||
甲砜霉素 | 353.9 | 289.9 | -75 | -18 |
184.9 | -75 | -28 | ||
氟苯尼考 | 356.0 | 119.0 | -80 | -23 |
184.9 | -80 | -12 |
注：“下划线”为定量离子。
结果与讨论
由表3可知，采用固相萃取结合液相色谱串联质谱的方法检测鱼肉中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素，加标回收率在70% ~ 115%之间，能够满足检测要求。由图 1可知，用venusil mp c18色谱柱检测氯霉素类药物，峰形良好，且保留时间稳定。
表3. 鱼肉中3种氯霉素类药物加标回收实验结果(添加水平1.0 µg/kg)
物质名称 | 保留时间/min | 平均回收率/% | cv/% |
氯霉素 | 6.78 | 114.3 | 0.4 |
甲砜霉素 | 5.18 | 78.2 | 8.9 |
氟苯尼考 | 6.51 | 98.4 | 5.0 |
实验谱图
图1. 0.02 µg/ml 3种氯霉素类药物混合标准溶液色谱图
结论
本实验建立了鱼肉中3种氯霉素类药物的前处理方法，并结合lc-ms/ms对样品进行了检测。 结果表明，对于加标量为4.0 µg/kg的鱼肉样品，加标回收率在70% ~ 115%之间，满足检测要求。说明该方法适用于鱼肉中氯霉素类药物的同时检测。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
cleanert® silica | 200 mg/3 ml | 50支/包 | si2003 |
venusil mp c18 | 3 µm，100 å，3.0 × 50 mm | 1支 | va930503-0 |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
15位氮吹仪 | 15位 | 1台 | nv15-g |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a; 1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
尼龙针式过滤器 | 单膜，13 mm，0.22 µm | 200个/包 | as021320 |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
qdaura® 卓睿全自动固相萃取系统 | 4通道 | 1台 | spe-40 |
应用编号：af10144
