前言
70年代末，人们发现从烤鱼或烤肉提取的化合物具有致突变性，对烤鱼中主要致突变物的研究表明，这类物质主要是复杂的杂环胺类化合物(heterocyclic amine)。长期实验表明，杂环胺在代谢活化系统中具有较强致突变性，并能引发啮齿动物以及灵长类动物肝脏、乳腺、结肠等多种靶器官产生肿瘤。与其他致癌物相比，杂环胺的毒性较强。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
ab sceix api 4000 液相色谱串联质谱仪。
试剂材料
甲醇、乙腈、乙醇、正己烷、二氯甲烷均为色谱纯；氢氧化钠为分析纯；实验用水为超纯水；
5种杂环胺类物质混合标准工作溶液：meiq、meiqx、4，8-dimeiqx、7，8-dimeiqx、phip：乙腈溶解；
基质混合标准工作溶液
取高浓度5种杂环胺类混合标准溶液，用空白样品基质溶液稀释成0.01 µg/ml的基质混合标准工作溶液。
cleanert® ps固相萃取小柱：200 mg/3 ml。
样品制备
样品提取
称取烤鱼试样2 g置于50 ml离心管中，加入10 ml 40 g/l氢氧化钠︰甲醇=70︰30（v/v）混合溶液，均质1 min。均质器刀头分别用5 ml上述溶液各洗涤两次，洗涤液合并至样品提取离心管中。提取液在10000 r/min条件下离心10 min，待净化。
样品净化
将cleanert® ps小柱依次用2 ml甲醇、3 ml 4 g/l氢氧化钠溶液活化平衡。量取10 ml提取液加入固相萃取主中，弃去流出液后，依次用3 ml 4 g/l氢氧化钠︰甲醇=45︰55（v/v）混合溶液、2 ml正己烷淋洗，每次淋洗完后都需将柱体内淋洗溶液抽干，最后用3 ml乙醇︰二氯甲烷=10︰90（v/v）混合溶液洗脱，洗脱流速小于1 ml/min。洗脱液于氮气浓缩至近干后，加入1 ml的10%乙腈水溶液复溶，涡旋混匀，过0.22 μm nylon针式过滤器，待检测。
以上净化步骤可用卓睿全自动固相萃取仪完成。
实验条件
色谱条件
色谱柱：venusil mp c18，3 µm，100 å，3.0 × 50 mm；
流动相a：0.1%甲酸水溶液；
流动相b：0.1%甲酸乙腈溶液；
柱 温：40℃；
进样量：5 µl。
梯度洗脱条件(见表1)
表1. 液相色谱梯度洗脱条件
时间/min | 流速/(ml/min) | a% | b% |
0.0 | 0.2 | 90 | 10 |
0.5 | 0.2 | 90 | 10 |
5 | 0.2 | 95 | 5 |
7 | 0.2 | 95 | 5 |
7.01 | 0.2 | 90 | 10 |
17 | 0.2 | 90 | 10 |
质谱条件
离子源：esi ；电喷雾电压：5500 v；雾化气压力：50 psi；气帘气压力：25 psi；辅助气压力：50 psi；离子源温度：500℃；采集方式：多反应监测(mrm)。
表2. 5种杂环胺类物质质谱参数
物质名称 | q1 | q3 | dp/v | ce/v |
meiq | 213.1 | 197.9 | 103 | 36.9 |
198.7 | 36.3 | |||
meiqx | 214.0 | 198.8 | 98 | 37.0 |
130.8 | 52.3 | |||
4，8-dimeiqx | 228.0 | 213.0 | 109 | 35.2 |
159.6 | 40.2 | |||
7，8-dimeiqx | 228.0 | 213.1 | 97 | 36.2 |
130.9 | 52.2 | |||
phip | 225.2 | 210.0 | 102 | 40.1 |
182.9 | 51.6 |
注：“下划线”为定量离子。
结果与讨论
由表3可知，采用spe结合lc-ms/ms的方法检测烤鱼中5种杂环胺类物质，加标回收率在65% ~ 95%之间，且变异系数小于10%，能够满足检测要求。由图1 ~ 图4可知，用venusil mp c18色谱柱检测5种杂环胺类，峰形良好，且保留时间稳定。
表3. 烤鱼中5种杂环胺类物质加标回收实验结果(添加水平0.01 mg/kg)
物质名称 | 保留时间/min | 平均回收率/% | cv% |
meiq | 1.74 | 93.5 | 1.4 |
meiqx | 3.98 | 66.1 | 3.8 |
4，8-dimeiqx | 6.04 | 82.7 | 3.1 |
7，8-dimeiqx | 6.04 | 80.7 | 5.9 |
phip | 6.57 | 72.4 | 3.0 |
图1. 0.01 µg/ml杂环胺类混合标准溶液lc-ms/ms色谱图
图2.烤鱼样品空白lc-ms/ms色谱图
图3. 0.01 µg/ml烤鱼基质混合标准溶液lc-ms/ms色谱图
图4. 0.01 mg/kg烤鱼基质加标lc-ms/ms色谱图
结论
本实验重现了gb5009.243-2016烤鱼中杂环胺类物质的前处理方法，并结合lc-ms/ms对样品进行了检测。结果表明，对于加标量为0.01 mg/kg的烤鱼样品，加标回收率在65% ~ 95%之间，满足检测要求，且变异系数小于10%，稳定性良好。说明该方法适用于烤鱼中5种杂环胺类物质的同时检测。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
cleanert® ps | 200 mg/3 ml | 30支/包 | ps2003 |
12位固相萃取真空装置 | 12位 | 1台 | vm12 |
卓睿全自动固相萃取仪 | 4通道，24位 | 1台 | spe-40 |
venusil mp c18 | 3 µm，100 å，3.0 × 50 mm | 1支 | va930503-0 |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
氮吹仪 | 15位 | 1台 | nv15-g |
1.5ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫45°shore a; 1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
尼龙针式过滤器 | 单膜，13 mm，0.22 µm | 200个/包 | as021320 |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
应用编号：af10163