前言
核苷酸是生命遗传物质dna和rna的基本组成单位，是体内合成核酸的前身物。婴幼儿正处在快速生长发育阶段，身体对核苷酸的需求量超过体内合成核苷酸的能力，但母乳可为婴幼儿提供所需核苷酸。而对于没有母乳喂养的婴幼儿，食用含足量核苷酸的配方奶粉，不仅可提高免疫力，也可保护婴幼儿肠胃健康。
表1. 5种核苷酸样品信息
样品名称 | 英文简称 | 结构式 | 分子式 | 分子量 | cas号 |
胞嘧啶核苷酸 | cmp |
| c9h14n3o8p | 323.2 | 63-37-6 |
次黄嘌呤核苷酸 | imp |
| c10h13n4o8p | 348.21 | 131-99-7 |
腺嘌呤核苷酸 | amp |
| c10h14n5o7p | 347.22 | 61-19-8 |
尿嘧啶核苷酸 | ump |
| c9h13n2o9p | 324.18 | 58-97-9 |
鸟嘌呤核苷酸 | gmp |
| c10h14n5o8p | 363.22 | 85-32-5 |
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
高效液相色谱仪，紫外检测器；
试剂材料
屈臣氏水；甲醇为色谱纯；
磷酸二氢钾色谱纯；磷酸、四丁基硫酸氢铵为分析纯；
胞嘧啶核苷酸对照品、腺嘌呤核苷酸对照品、尿嘧啶核苷酸对照品、次黄嘌呤核苷酸对照品、鸟嘌呤核苷酸对照品：由某乳制品公司提供；
高效液相色谱柱：venusil® c18 plus； 5 μm，120 å，4.6 × 250 mm；
样品制备
5种核苷酸混合标准溶液：分别称取核苷酸标准品cmp、amp、ump各10 mg、gmp、imp各5 mg (精确至0.1 mg) ，用水溶解成并定容至100 ml，混匀，即得；
某品牌婴幼儿奶粉样品溶液：称取5.0 g奶粉样品，用20 ml热水 (50~60℃) 充分溶解试样，冷却至室温；用10%乙酸溶液调节ph至4.1，移至50 ml容量瓶中，定容，滤纸过滤，所得滤液用0.45 μm滤膜过滤，即得样品溶液。
色谱条件
色谱柱：venusil® c18 plus； 5 μm，120 å，4.6 × 250 mm；
流动相：称取1.360g磷酸二氢钾，加0.4753 g四丁基硫酸氢铵至1000 ml容量瓶中，用水补齐至刻度，准确加2.5ml磷酸和40ml甲醇，混匀后超声10min。
（备注：由于流动相中含离子对试剂，色谱柱需要先用流动相平衡至少90min后，再运行4针标准品，系统才能稳定）
波 长：254 nm；
柱 温：30℃；
流 速：1.0 ml/min；
进样量：10 µl。
结果与讨论
本实验按照gb 5413.40-2016婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定中方法，使用venusil® c18 plus色谱柱对5种核苷酸混合标准溶液、婴幼儿奶粉样品溶液进行检测，由以下结果可知，婴幼儿奶粉样品中五种核苷酸与杂质的分离度大于1.5，回收率97%~109%，满足实验需求。
表2. 5种核苷酸实验数据
样品名称 | 化合物名称 | 保留时间/min | 理论塔板数 | 分离度 | 拖尾因子 | 备注 |
5种核苷酸混标 | cmp | 3.660 | 15803 | — | 0.98 | 图1 |
amp | 5.608 | 16882 | 13.46 | 0.97 | ||
gmp | 11.061 | 18806 | 21.99 | 0.96 | ||
ump | 21.226 | 21178 | 22.40 | 0.98 | ||
imp | 26.011 | 20584 | 7.30 | 0.99 |
图1.venusil® c18 plus色谱柱5种核苷酸混标高效液相色谱图
图2.venusil® c18 plus色谱柱婴幼儿奶粉样品溶液高效液相色谱图
表3. 某品牌婴幼儿奶粉5种核苷酸实验数据
化合物名称 | 保留时间/min | 分离度 | 拖尾因子 | 备注 |
cmp | 3.659 | — | 0.99 | 图2，图3 |
杂质1 | 4.342 | 5.73 | - | |
amp | 5.605 | 8.48 | 0.94 | |
杂质2 | 6.081 | 2.74 | - | |
gmp | 11.051 | 18.91 | 0.97 | |
杂质3 | 19.841 | 20.47 | - | |
ump | 21.223 | 2.57 | 0.95 | |
imp | 26.015 | 7.30 | 0.99 |
图3.venusil® c18 plus色谱柱婴幼儿奶粉样品溶液高效液相色谱图(纵坐标局部放大图)
表4. 某品牌婴幼儿奶粉5种核苷酸加标实验结果
化合物名称 | 保留时间/min | 加标浓度（ug/ml） | 回收率（%） | 备注 |
cmp | 3.660 | 12.2 | 108.4 | 图4 |
amp | 5.605 | 7.6 | 101.8 | |
gmp | 11.050 | 9.2 | 97.7 | |
ump | 21.213 | 14.8 | 106.3 | |
imp | 26.028 | 11 | 101.9 |
图4.venusil® c18 plus色谱柱婴幼儿奶粉样品加标溶液高效液相色谱图
结论
本实验按照gb5413.40-2016婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定中方法，使用venusil® c18 plus色谱柱对5种核苷酸混合标准溶液、婴幼儿奶粉样品溶液进行检测，结果表明在上述实验条件下，venusil® c18 plus色谱柱可用于婴幼儿奶粉中5种核苷酸的分析检测。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
venusil® c18 plus | 5 μm，120å；4.6 × 250mm | 1支 | vps952505-a |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫 45°shore a；1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜 | 单膜，13 mm，0.45 μm | 100个/包 | as021345-t |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
应用编号：af10154