前言
氨基酸是构成蛋白质的基本物质，蛋白中的氨基酸都是l型的，只有l型的才能被人体直接利用，d型氨基酸由于难以被细菌降解，不易产生抗药性而成为酶抑制剂的重要合成前体， l-天冬氨酸在医药上主要用于钾、钙等无机离子的补充剂，疲劳回复剂。d-天冬氨酸是一种重要的手性化合物，在医药、食品等方面起着很重要的作用。目前分离氨基酸对映体的方法很多，如酶解拆分、手性色谱、高效液相色谱等。用高效液相色谱法拆分氨基酸对映体分为直接法和间接法两种途径，直接法是采用手性固定相或手性流动相进行拆分，间接法即柱前衍生化法，分离条件简单，分离效果好。本实验采用间接法，用邻苯二甲醛（opa）作为衍生试剂对d-l天冬氨酸进行柱前衍生，衍生化反应如下：
表1.天冬氨酸化学信息
样品名称 | 英文名 | 结构式 | 分子式 | 分子量 | cas号 |
天冬氨酸 | aspartic acid |
| c4h7no4 | 133.1 | 6899-03-2 |
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
高效液相色谱仪，紫外检测器；
试剂材料
实验用水为屈臣氏蒸馏水；磷酸氢二钠与十水合四硼酸钠均为分析纯试剂；
d-l门冬氨酸对照品：白色粉末，由某药业集团股份有限公司提供；
高效液相色谱柱：venusil® c18 plus；5 μm，120 å，4.6 × 250 mm。
色谱条件
色谱柱：venusil® c18 plus；5 μm，120 å，4.6 × 250 mm；
缓冲液：称取十二水合磷酸氢二钠9.0g，十水合四硼酸钠9.5g，加水2000ml溶解，用36%盐酸调节ph至8.2，用0.45μm滤膜过滤；
流动相：缓冲液︰甲醇=98︰2(v/v)；
流 速：1.0 ml/min；
波 长：338nm；
柱 温：25℃；
进样量：5 µl。
样品制备
称取d、l-天冬氨酸粉末5.0 mg，分别置于两个10 ml容量瓶中，加0.1 mol/l盐酸溶解并稀释至刻度，分别制得每1.0 ml中含0.5 mg的溶液；
分别称取d、l-天冬氨酸粉末5.0 mg，置10 ml容量瓶中，加0.1 mol/l盐酸溶解并稀释至刻度，制得每1.0 ml中分别含d、l-天冬氨酸0.5 mg的溶液；
样品衍生
准确量取durashell aa氨基酸分析手册中的硼酸盐缓冲液50 µl，置1.0 ml离心管中，加入样品溶液20 µl，混匀，加入durashell aa氨基酸分析手册中的opa衍生试剂10 µl，混匀，放置1.0 min，即得。
结果与讨论
本实验采用高效液相色谱 (hplc) 法结合紫外检测器，使用邻苯二甲醛（opa）、n-乙酰-半胱氨酸为衍生试剂，对天冬氨酸对映体进行柱前衍生，测得混合对照溶液中d-l天冬氨酸对映体的分离效果较好。
表2.天冬氨酸分析结果
样品名称 | 序号 | 化合物名称 | 保留时间/min | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 分离度 | 备注 |
混合对照溶液 | 1 | d-天冬氨酸 | 10.610 | 10176 | 1.331 | — | 图1 |
2 | l-天冬氨酸 | 11.501 | 10585 | 1.364 | 2.05 | ||
d-天冬氨酸对照溶液 | 1 | d-天冬氨酸 | 10.628 | 9726 | 1.352 | — | 图2 |
l-天冬氨酸对照溶液 | 1 | l-天冬氨酸 | 11.511 | 10899 | 1.378 | — | 图3 |
图1.混合对照溶液高效液相色谱图
图2.d-天冬氨酸对照品溶液高效液相色谱图
图3. l天冬氨酸对照品溶液高效液相色谱图
结论
本实验采用高效液相色谱 (hplc) 法结合紫外检测器，使用邻苯二甲醛（opa）、n-乙酰-半胱氨酸为衍生试剂，对天冬氨酸对映体进行柱前衍生，测得混合对照溶液中d-l天冬氨酸对映体的分离度为2.05，能够满足检测要求。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
venusil® c18 plus | 5 μm，120 å，4.6 × 250 mm | 1支 | vps952505-a |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫45°shore a；1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜 | 单膜，13 mm，0.45 μm | 100个/包 | as021345-t |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
应用编号：ap10207