前言
氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
本实验采用durashell aa氨基酸分析方法包中的检测标准，使用durashell aa氨基酸分析专用柱对土鳖虫微粉中游离氨基酸进行测试。
实验部分
仪器、试剂与材料
试剂材料
流动相a：称取十二水合磷酸氢二钠7.2 g，十水合四硼酸钠7.6 g，加水2000 ml，用盐酸（约3.0 ml）调节ph至8.2，用0.45μm滤膜过滤；
流动相b：取甲醇450 ml，乙腈450 ml，水100 ml，混匀，超声脱气；
稀盐酸：取36%盐酸4.16 ml，加水稀释至500 ml；
衍生试剂（opa）：取durashell aa氨基酸分析方法包中opa-a试剂1支，加入opa-b试剂60 µl，混匀，即得；
稀释剂：取100 ml流动相a,加磷酸0.5 ml，混匀；
混合氨基酸对照品：(l-门冬氨酸、l-谷氨酸、l-丝氨酸、甘氨酸、l-组氨酸、l-精氨酸、l-苏氨酸、l-丙氨酸、l-脯氨酸、氯化铵、l-酪氨酸、l-缬氨酸、l-甲硫氨酸、l-是色氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-苯丙氨酸、l-赖氨酸浓度为2.5 μmol/ml, l-胱氨酸浓度为1.25 μmol/ml)；
土鳖虫微粉：褐色粉末，由某药科大学提供。
样品制备
衍生用混合氨基酸标准溶液：准确量取氨基酸分析方法组件包中的氨基酸标准溶液100 μl，置于2 ml样品瓶中，准确加入内标溶液50 μl， 0.1 mol/l盐酸溶液400 μl，混匀，作为衍生用混合氨基酸标准溶液；
衍生用土鳖虫微粉样品溶液：准确称取样品0.5 g，加乙腈/水=50/50（v/v）25 ml，混匀，超声处理30 min，经0.45 μm针筒过滤器过滤，取续滤液作为样品试液，准确量取样品溶液500 μl，置于2.0 ml样品瓶中，准确加入内标溶液50 μl，混匀，作为衍生用样品溶液。
色谱条件
色谱柱：durashell aa；3 μm；4.6 × 150 mm；
柱 温：45℃；
波 长：338 nm(22 min切换波长为262 nm)；
进样量：2 μl；
衍生程序：durashell aa氨基酸分析方法包中氨基酸衍生程序；
梯 度：
表1.液相色谱梯度洗脱条件
时间/min
| a/% | b/% | 流速ml/min |
0 | 95 | 5 | 1.6 |
6 | 90 | 10 | 1.6 |
8 | 90 | 10 | 1.6 |
10 | 84 | 16 | 1.2 |
23 | 58 | 42 | 1.2 |
25 | 33 | 67 | 1.6 |
28 | 0 | 100 | 1.6 |
31 | 0 | 100 | 1.6 |
32 | 95 | 5 | 1.6 |
35 | 95 | 5 | 1.6 |
结果与讨论
本实验采用durashell aa 氨基酸分析方法包对土鳖虫微粉中氨基酸进行了测试，由图2可知，使用durashell aa氨基酸分析方法包共检测出土鳖虫微粉中17种游离氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好。
图1. 19种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图
按出峰顺序依次为：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸(内标)、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、铵离子、脯氨酸。
图2. 土鳖虫微粉样品溶液高效液相色谱图
按出峰顺序依次为：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、正缬氨酸(内标)、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、铵离子、脯氨酸。
结论
根据实验结果，使用durashell aa 氨基酸分析方法包共检测出土鳖虫微粉样品中17种游离氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好，能够满足检测要求。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
durashell aa氨基酸分析方法包 | — | 1 | aa952505-k |
durashell aa氨基酸分析专用柱 | 4.6 × 250 mm，5 μm | 1 | aa952505-0 |
1.5 ml样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5 ml样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色ptfe隔垫45°shore a；1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜 | 单膜，13 mm，0.45 μm | 100个/包 | as021345-t |
一次性注射器 | 2 ml无针头 | 100支/包 | lzsq-2ml |
甲醇 | 4 l/瓶，色谱纯 | 4×4 l/箱 | ah230-4 |
应用编号：ap10081